一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用，包括所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明专利技术还提供了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体及构建方法，所述表达载体包含所述融合蛋白的核苷酸。本发明专利技术属于基因工程技术领域；本发明专利技术通过融合植物抗菌肽AFP1与分泌信号肽SPamyQ设计得到融合蛋白AFP1

【技术实现步骤摘要】
一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体是指一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等各种细菌以及动物寄生虫、真菌、病毒等导致的感染长期以来是畜牧、禽蛋养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展，尤其每年由细菌性感染导致的直接经济损失高达数十亿元，由于抗生素的长期使用产生耐药菌，耐药菌引起的腹泻与感染日益严重，自抗生素禁用以后，畜牧业中主要以添加中药和益生菌解决临床疾病预防问题，但中药材成本高，长期使用后在动物体内残留、富集，直接影响了畜产品的品质和间接损害人类的健康，而普通益生菌功效不足，因此亟待需要安全、新型抗生素替代品来控制疾病和促进动物健康生长。
[0003]芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌是应用最多的微生物添加剂菌种，芽孢杆菌由于稳定性好、抗逆性强、复活率高，通过与病原菌竞争营养物质、抑制病原菌等提高机体的免疫机能，并提供营养物质等作用，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。
[0004]植物防御素抗菌肽（英文简写为AFP1）仅由51个氨基酸组成，是一种小而富含半胱氨酸的肽，核磁共振分析显示，AFP1由一个α
‑
螺旋和一个三链反平行β片组成，研究发现，AFP1对人类HepG2细胞无毒性，最高可达40 μM，因此AFP1缺乏一般的细胞毒性活性，目前，在畜牧业中尚未被应用于防治由细菌性感染造成的腹泻等疾病，此外，由于抗菌肽AFP1来源于植物（真核生物）中，因此直接在原核生物中表达受限，表达量低下，以及易被降解、无法进入禽畜的肠道内进行抑菌杀菌作用。

技术实现思路

[0005]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用，为了解决植物来源抗菌肽AFP1在原核生物中表达量低下、易被降解的问题，本专利技术通过融合植物抗菌肽AFP1与分泌信号肽SPamyQ设计得到融合蛋白AFP1
‑
S，有效地保障了抗菌肽AFP1在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答，进一步本专利技术通过体外抑菌拮抗试验证实了本专利技术提供的融合蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抑菌活性，本专利技术首次报道应用植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白治疗细菌性感染导致的禽畜类疾病，降低了抗生素的使用风险并提高了经济效益。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术提出了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]优选地，所述融合蛋白的表达宿主为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。
[0008]进一步，本专利技术还提供了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体，所述表达载体包含所述融合蛋白的核苷酸。
[0009]进一步地，本专利技术还提供了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤一：以人工合成的基因AFP1
‑
S为模板，使用引物进行PCR扩增得到带有酶切位点的AFP1
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S片段；步骤二：使用限制性内切酶切割载体与AFP1
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S片段，采用同源重组酶连接载体与AFP1
‑
S片段得到连接产物；步骤三：将所述连接产物转化大肠杆菌感受态中获得阳性克隆子，然后提取所述阳性克隆子的质粒，经过DNA测序验证后，得到所述融合蛋白的表达载体。
[0010]优选地，所述载体为pWUKANG01，所述融合蛋白的表达载体为pWUKANG01
‑
AFP1
‑
S，所述限制性内切酶为XholⅠ。
[0011]优选地，所述引物为5
’‑
GCGGTACCGAGCTCGCTCGAG
‑3’
和5
’‑
TGCAGCGGCTAGCCCCTCGAGTCA
‑3’
，所述引物与目的基因互补，并且提供限制性内切酶的保护信号，所述引物上设有与载体上15
‑
18 bp的同源序列，可以更方便的与载体连接。
[0012]本专利技术还提供了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的应用，包括如下任一一条：（1）所述融合蛋白应用于构建预防和治疗禽畜细菌性腹泻的工程菌株；（2）所述融合蛋白应用于制备预防和治疗禽畜细菌性腹泻的药物。
[0013]优选地，所述细菌性腹泻包括由沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的一种或者多种引起的腹泻。
[0014]采用上述方案本专利技术取得的有益效果如下：本方案提出了一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用：（1）本专利技术通过设置芽孢杆菌内源的分泌肽SPamyQ片段保护了植物抗菌肽AFP1的独立折叠，使融合蛋白分泌后在枯草芽孢杆菌外周被分泌蛋白酶激酶识别并切割成独立的活性结构域，有效地保障了抗菌肽AFP1在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答；（2）分泌性表达载体pWUKANG01在多克隆位点前面没有分泌信号肽序列，因此设计补充分泌信号肽SPamyQ与植物抗菌肽AFP1融合，分泌信号肽能高效的将重组蛋白分泌到胞外；（3）表达载体pWUKANG01
‑
AFP1
‑
S允许在细胞质中高水平表达重组蛋白；（4）表达载体pWUKANG01
‑
AFP1
‑
S能够去除在克隆过程中所使用的Amp抗性基因片段，通过ECOR
ꢀⅠ
，可实现双酶切去除Amp基因，从而避免抗性基因的影响；（5）本专利技术中所述融合蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌均具有显著抑制作用，枯草芽孢杆菌BS168
‑
AFP1
‑
S分泌表达的融合蛋白复合物可以通过直接的抑杀大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等修复受损的肠道黏膜；
（6）所述融合蛋白在分泌表达后在芽孢杆菌体外和肠道内自动分割为单独的活性蛋白，融合蛋白能够调节各类肠道细胞的细胞周期，加速修复与提高肠道免疫力，肠道黏膜层富集有大量的粒细胞与巨噬细胞，而肠系膜淋巴结富集有大量的免疫淋巴细胞，融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结同时行使功能并发挥作用，既可以杀灭感染的细菌，也可以同时修复肠道，提高免疫力，实现多种益生功能；（7）本专利技术中所述融合蛋白应用广泛，可以降低腹泻率，提高日增重及饲料消化率，降低料肉比，提高蛋壳厚度及质量等。
附图说明
[0015]图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的表达宿主为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。3.一种根据权利要求1所述的植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体，其特征在于：所述表达载体包含所述融合蛋白的核苷酸。4.一种根据权利要求3所述的植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：步骤一：以人工合成的基因AFP1
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S为模板，使用引物进行PCR扩增得到带有酶切位点的AFP1
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S片段；步骤二：使用限制性内切酶切割载体与AFP1
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S片段，采用同源重组酶连接载体与AFP1
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S片段得到连接产物；步骤三：将所述连接产物转化大肠杆菌感受态中获得阳性克隆子，然后提取所述阳性克隆子的质粒，经过DNA测序后，得到所述融合蛋白的表达载体。5.根据权利要求4所述的一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白的表达载体的构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩赛虎，万小平，
申请(专利权)人：五康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：