一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用，本发明专利技术提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽能够解决瓦氏黄颡鱼鱼苗抗菌力差以及存活率低的技术问题。本发明专利技术还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法采用瓦氏黄颡鱼头肾组织中的抗菌肽Hepcidin和β

【技术实现步骤摘要】
一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体公开了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是在外界条件刺激下，动物免疫系统产生的一类对抗外源性病原体侵袭的防御性活性肽类物质，是动物非特异性免疫防御系统的重要组成部分，能够通过“溶解性”破坏或“离子”造孔来防御多种细菌、真菌、病毒及其他病原生物的感染。近年来，抗菌肽作为一种新型的高效抗菌药物，由于其具有分子量小、水溶性好、稳定性强、耐酸碱、抗菌谱广且作用机制特别，不易产生耐药性等优点，成为新型抗生素替代品开发的良好候选资源。
[0003]虽然目前已经有两千多种抗菌肽被鉴定或研究，但是大多数天然抗菌肽都表现出活性较低、不稳定、具有一定的细胞毒性和产量低等缺点。随着对抗菌肽作用机制、分子结构与功能关系等研究的逐步深入，人们在发掘新抗菌肽的同时，更注重寻找高效、广谱、稳定、低毒、肽链较短的抗菌肽，其中杂合肽即为一类这样的新型抗菌肽。
[0004]瓦氏黄颡鱼(学名：Pelteobagrus vachelli)是鲿科、黄颡鱼属一种常见的淡水鱼，由于其具有肉质鲜美、营养丰富、生长迅速和抗病力强等特点，受到广大消费者、养殖户和科研工作者的青睐，逐渐成为一种用于遗传育种、营养饲料和疾病防控研究的模式试验鱼类。然而随着养殖密度的提高，养殖水环境恶化，导致瓦氏黄颡鱼的疾病频繁爆发，特别是细菌性疾病危害最大。因此，开展瓦氏黄颡鱼抗菌肽的系统研究，对瓦氏黄颡鱼抗病机制阐述、抗病新品种培育及其抗菌肽产品开发具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽能够解决瓦氏黄颡鱼鱼苗抗菌力差以及存活率低的技术问题。
[0006]本专利技术的第二目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法采用瓦氏黄颡鱼头肾组织中的抗菌肽Hepcidin和β
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defensin为母肽进行合成，该方法步骤简单、容易操作，方便瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的批量生产。
[0007]本专利技术的第三目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用。
[0008]本专利技术的第四目的在于提供一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率的制剂。
[0009]首先，本专利技术提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽能够有效提高瓦氏黄颡鱼对于病菌的抗病能力，从而提高瓦氏黄颡鱼鱼苗的存活率。
[0010]其次，本专利技术还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：去掉瓦氏黄颡鱼抗菌肽β
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defencin的第1
‑
20个氨基酸和第47
‑
49个氨基酸、删除第36位和第
42位的半胱氨酸、将第23位的异亮氨酸替换为赖氨酸以及将第28位的谷氨酸替换为精氨酸，得到dcBD1，dcBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；删除瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的α螺旋两端的多余序列并保留第8
‑
17个氨基酸区段，得到dcHEP2，dcHEP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；将dcBD1与dcHEP2组合，得到dcBD1
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HEP2，即得到瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽。该方法通过条件优化，获得高产、无毒、高活性的杂合抗菌肽产物，此外该方法简单方便容易操作，能够便于该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽得到大批量生产。
[0011]接着，本专利技术还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用。
[0012]最后，本专利技术还提供了一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活力的制剂。
[0013]与现有技术相比，本专利技术至少具有如下的优点与积极效果：
[0014]一、本专利技术提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽能够有效提高瓦氏黄颡鱼对于病菌的抗病能力，从而提高瓦氏黄颡鱼鱼苗的存活率。
[0015]二、本专利技术还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法通过条件优化，获得高产、无毒、高活性的杂合抗菌肽产物，此外该方法简单方便容易操作，能够便于该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽得到大批量生产。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0017]图1为本专利技术实施例中PCR扩增结果图；
[0018]图2为本专利技术实施例中信号肽分析结果图；
[0019]图3为本专利技术实施例中跨膜区分析结果图；
[0020]图4为本专利技术实施例中hepcidin核酸序列及氨基酸序列功能位点分析结果；
[0021]图5为本专利技术实施例中β
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defensin核酸序列及氨基酸序列功能位点分析；
[0022]图6为本专利技术实施例中hepcidin氨基酸序列同源性比对结果；
[0023]图7为本专利技术实施例中β
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defensin氨基酸序列同源性比对结果；
[0024]图8为本专利技术实施例中瓦氏黄颡鱼hepcidin氨基酸序列的系统进化树分析；
[0025]图9为本专利技术实施例中瓦氏黄颡鱼β
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defensin氨基酸序列的系统进化树分析；
[0026]图10为本专利技术实施例中瓦氏黄颡鱼hepcidin基因结构示意图；
[0027]图11为本专利技术实施例中瓦氏黄颡鱼β
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defensin基因结构示意图；
[0028]图12为本专利技术实施例中两种抗菌肽氨基酸序列3D结构预测图，其中A为hepcidin，B为β
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defensin；
[0029]图13为本专利技术实施例中杂合抗菌肽氨基酸序列分析结果；
[0030]图14为本专利技术实施例中杂合抗菌肽的溶血性分析；
[0031]图15为本专利技术实施例中重组载体的酶切鉴定结果；
[0032]图16为本专利技术实施例中杂合抗菌肽毕赤酵母表达鉴定；
[0033]图17为本专利技术试验例中毕赤酵母表达杂合抗菌肽抑菌动力学分析；
[0034]图18为本专利技术试验例中毕赤酵母表达的杂合抗菌肽溶血率分析；
[0035]图19为本专利技术试验例中发病鱼塘及发病鱼症状。
具体实施方式
[0036]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，其特征在于，该杂合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种如权利要求1所述的瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：去掉瓦氏黄颡鱼抗菌肽β
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defencin的第1
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20个氨基酸和第47
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49个氨基酸、删除第36位和第42位的半胱氨酸、将第23位的异亮氨酸替换为赖氨酸以及将第28位的谷氨酸替换为精氨酸，得到dcBD1，所述dcBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；删除瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的α螺旋两端的多余序列并保留第8
‑
17个氨基酸区段，得到dcHEP2，所述dcHEP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；将所述dcBD1与所述dcHEP2组合，得到dcBD1
‑
HEP2，即得到所述瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽。3.根据权利要求2所述的瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述瓦氏黄颡鱼抗菌肽β
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defencin和所述瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的制备包括如下步骤：以斑点叉尾鮰抗菌肽Hepcidin和β
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defensin为参考序列并用瓦氏黄颡鱼头肾转录组数据作为对比，设计得到Hepcidin引物对和β
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defensin引物对；提取瓦氏黄颡鱼头肾组织中的RNA并反转录为cDNA，将所述Hepcidin引物对和所述β
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defensin引物对分别与所述cDNA混合进行PCR扩增并纯化，得到纯化产物，将所述纯化产物与克隆载体连接后转化至DH5α感受态细胞中，经AMP抗性平板筛选并进行菌落PCR鉴定，将鉴定阳性的菌落进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：王均，贺扬，覃川杰，谢碧文，王永明，张志勇，李锐，史庆超，文正勇，胡鹏，李华涛，
申请(专利权)人：内江师范学院，
类型：发明
国别省市：