一种基于天然配体制备靶向HER2/EGFRCAR-T的方法及应用技术

本发明专利技术提供了基于天然配体制备靶向HER2/EGFR CAR

【技术实现步骤摘要】
一种基于天然配体制备靶向HER2/EGFR CAR
‑
T的方法及应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种基于天然配体制备靶向 HER2/EGFR CAR
‑
T的方法及应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)免疫疗法是近年来发展起来的一种新兴细胞 免疫疗法，自在血液肿瘤中取得巨大成功后，目前有大量的临床研究。不幸的 是，尽管CAR
‑
T细胞可以在体外杀死实体瘤细胞并在临床前小鼠模型中成功抑 制肿瘤生长，但在临床试验中，它在实体瘤的治疗方面进展甚微。这可能归因 于几个原因，其中最重要的两个原因是癌细胞上抗原表达的微环境和异质性。 在临床前小鼠模型中观察到，肿瘤细胞的复杂且抑制性微环境可能会阻止 CAR
‑
T细胞进入肿瘤块，抑制CAR
‑
T细胞的毒性并使CAR
‑
T细胞耗尽。癌细胞 上抗原表达的异质性使得难以通过单个特异性CAR
‑
T根除所有肿瘤细胞，靶抗 原表达的丢失使肿瘤细胞逃避了CAR
‑
T。
[0003]HER2和EGFR均属于表皮生长因子受体家族。表皮生长因子受体家族由 HER1(EGFR)至HER4组成。HER2被发现在乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、 膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌等多种肿瘤中过表达；而在成胶质细 胞瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等中，经常发现EGFR突变和过表达。它们均作 为驱动基因在促进肿瘤中发挥重要作用，是靶向治疗的重要靶标。
[0004]据报道，几种靶向HER2或EGFR的CAR
‑
T可有效杀死癌细胞，但是CAR
‑
T 都是基于HER2或EGFR抗体的部分肽段来制备的，这可能带来某些副作用，并 可能引起抗原的丢失和肿瘤细胞逃逸。
[0005]基于天然配体
‑
受体的制备的CAR比源自抗体的CAR具有优势。基于天然 配体受体的EGFR CAR在小鼠模型中对体内和体外肿瘤细胞均表现出有效的作 用。然而，由于缺乏众所周知的HER2配体，因此没有基于天然配体
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受体的CAR 靶向HER2。
[0006]因此，本领域迫切需要开发一种基于天然配体
‑
受体的能够高效靶向EGFR 和HER2的嵌合抗原受体T细胞。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的就是提供一种基于天然配体
‑
受体的能够高效靶向EGFR和 HER2的嵌合抗原受体T细胞。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种基于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)改造 的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够同 时靶向HER2和EGFR。
[0009]在另一优选例中，所述的胞外结合域具有来源于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD) 的氨基酸序列。
[0010]在另一优选例中，所述的胞外结合域包括脯氨酸肽酶或其片段。
[0011]在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段与HER2和EGFR均具有特异 性结合。
[0012]在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段具有如SEQ ID NO:1所示 的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示序列的N端第1至250
‑
350位(较 佳地为N端第1至300
‑
320位，更佳地第1至309位)的氨基酸序列。
[0013]在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段的氨基酸序列选自下组：
[0014](i)如SEQ ID NO:1所示序列的第1至309位所示的序列；和
[0015](ii)在如SEQ ID NO:1所示序列的第1至309位所示序列的基础上，进 行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1 至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基， 从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示序列 的第1至309位所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、 ≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性。
[0016]在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：
[0017]L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀꢀ
(I)
[0018]式中，
[0019]各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
[0020]L是无或信号肽序列；
[0021]EB是胞外结合域；
[0022]H是无或铰链区；
[0023]TM是跨膜结构域；
[0024]C是无或共刺激信号分子；
[0025]CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
[0026]RP是无或报告蛋白。
[0027]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点， 优选地为T2A序列。
[0028]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为荧光蛋白。
[0029]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白。
[0030]在另一优选例中，所述的mKate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0031]在另一优选例中，所述的L是选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM
‑
CSF、 CD4、CD137、或其组合。
[0032]在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0033]在另一优选例中，所述的H是选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、 或其组合。
[0034]在另一优选例中，所述的H是CD8来源的铰链区。
[0035]在另一优选例中，所述H的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0036]在另一优选例中，所述的TM是为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、 CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
[0037]在另一优选例中，所述的TM是CD28来源的跨膜区。
[0038]在另一优选例中，所述TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0039]在另一优选例中，所述的C是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、 CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4
‑
1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、 ICAM
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)改造的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够同时靶向HER2和EGFR。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的胞外结合域包括脯氨酸肽酶或其片段，所述的脯氨酸肽酶或其片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示序列的N端第1至250
‑
350位(较佳地为N端第1至300
‑
320位，更佳地第1至309位)的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR的结构如下式I所示：L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀꢀ
(I)式中，各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；L是无或信号肽序列；EB是胞外结合域；H是无或铰链区；TM是跨膜结构域；C是无或共刺激信号分子；CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；R...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭东，涂秋，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：