猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。本发明专利技术公开的疫苗活性成分为由融合蛋白(CSFV

【技术实现步骤摘要】
猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物制品领域，具体涉及一种预防猪瘟的多聚体疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Hogcholera virus，Swine fever virus，简称CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。该传染病于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病，是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想。
[0003]CSFV为有囊膜病毒，40～60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基、分子量约438kD的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，共编码4个结构蛋白(C、E
rns
(E0)、E1和E2)和8个非结构蛋白(N
pro
、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。
[0004]E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，是主要的抗原蛋白。在体外，E2可诱导产生病毒的中和抗体，在体内可诱导产生抗CSFV的攻击抗体。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51～58kDa。E2分子内的15个半胱氨酸(Cys)残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。
[0005]白喉毒素是一种蛋白，由535个氨基酸组成，共有两个亚基，亚基间通过二硫键连接。分子量为62kD，含有两个与有14个氨基酸的环相结合的双硫桥，分子具有毒性及产生特定免疫力的特征。白喉毒素197是白喉毒素一个突变体，其52位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，使毒素丧失活性，对细胞不产生毒性作用，但其抗原和免疫活性仍然与天然毒素一致。
[0006]IgG融合蛋白主要特点是包含Fc段，与单克隆抗体Fc功能类似。融合蛋白可以延长蛋白的半衰期，当Fc与Fc受体(FcRn)结合，在受体的保护下，半衰期可延长至21天。同时提高分子量，降低身体清除率，Fc通过二硫键连接形成二聚体，对补加轻链免疫刺激物进一步改造可以形成聚体复合物，提高分子稳定性，同时Fc结构与免疫细胞表面的Fc受体结合，发挥IgG和白喉毒素各种生物学功能，主要包括调节细胞因子分泌、调节B细胞增值分化及提高抗体滴度等。除此之外，Fc可以特异性地与ProteinA结合，简化纯化步骤，在生物制品中有重要意义。
[0007]SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，二者能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，是可以基因编码的化学反应。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是如何提高猪瘟E2亚单位疫苗的稳定性和/或延长其半衰期，增强其免疫效果。
[0009]为解决上述技术问题，第一个方面，本专利技术提供蛋白质，所述蛋白质由融合蛋白(CSFV
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E2)
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SpyTag
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HIgG和融合蛋白CRM197
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SpyCatcher
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LIgG连接而成，
[0010]所述融合蛋白(CSFV
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E2)
‑
SpyTag
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HIgG为下述A1)
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A3)中任一种：
[0011]A1).氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
[0012]A2).A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性，且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；
[0013]A3).在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0014]所述融合蛋白CRM197
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SpyCatcher
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LIgG为下述B1)
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B3)中任一种：
[0015]B1).氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
[0016]B2).B1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；
[0017]B3).在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0018]其中，SEQ ID No.3中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～379位为CSFV
‑
E2的氨基酸序列，第380～402位为Linker和SpyTag多肽的氨基酸序列，第403～722位为猪IgG重链恒定区Fc的氨基酸序列，也可以含此全部序列中部分序列；SEQ ID No.4中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～554位为CRM197毒素的氨基酸序列，第555～678位为Linker和SpyCatcher多肽的氨基酸序列，第679～780位为猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列，也可以含此全部序列中部分序列。
[0019]所述融合蛋白(CSFV
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E2)
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SpyTag
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HIgG从N端到C端分别是CSFV
‑
E2、SpyTag多肽和猪IgG重链恒定区，也可以含此全部序列中部分序列。所述融合蛋白CRM197
‑
SpyCatcher
‑
LIgG从N端到C端分别是CRM197、SpyCatcher多肽和猪IgG轻链恒定区，也可以含此全部序列中部分序列。其中SpyTag与SpyCatcher能够重组，并自发形成异肽键偶联，从而将所述融合蛋白(CSFV
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E2)
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SpyTag
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HIgG和所述融合蛋白CRM197
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SpyCatcher
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LIgG连接。两条猪IgG重链恒定区通过在铰链区形成二硫键连接。
[0020]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0021]所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
[0022]为解决上述技术问题，第二个方面，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质由融合蛋白(CSFV
‑
E2)
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SpyTag
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HIgG和融合蛋白CRM197
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SpyCatcher
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LIgG连接而成；所述融合蛋白(CSFV
‑
E2)
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SpyTag
‑
HIgG为下述A1)
‑
A3)中任一种：A1).氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；A2).A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性，且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；A3).在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述融合蛋白CRM197
‑
SpyCatcher
‑
LIgG为下述B1)
‑
B3)中任一种：B1).氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；B2).B1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；B3).在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。2.与权利要求1所述蛋白质相关的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由编码所述融合蛋白(CSFV
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E2)
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SpyTag
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HIgG的核酸分子和编码所述融合蛋白CRM197
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SpyCatcher
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LIgG的核酸分子组成；所述编码融合蛋白(CSFV
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E2)
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SpyTag
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HIgG的核酸分子为下述g11)
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g13)中任一种，g11).编码链的编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；g12).编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；g13).与g11)或g12)限定的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：查银河，盖其静，余晓玉，张稳涛，
申请(专利权)人：浙江洪晟生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：