一种基因编辑融合蛋白、其构建的腺嘌呤碱基编辑器及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基因编辑融合蛋白、其构建的腺嘌呤碱基编辑器及其应用。基因编辑融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑融合蛋白、其构建的腺嘌呤碱基编辑器及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基因编辑融合蛋白、其构建的腺嘌呤碱基编辑器及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑是通过在DNA上特定位点引入序列改变，达到基因的敲除、外源DNA片段插入或者DNA碱基突变的技术手段。CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用非常广泛，目前已经发现了三种CRISPR/Cas系统，Type I，Type II和Type III，其中Type II系统是目前改造最成功的人工核酸酶，只需一个Cas9蛋白就能发挥CRISPR系统的免疫作用。在该系统中，crRNA(CRISPR
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derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans
‑
activating crRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。作用过程包括三个阶段：(1)获得CRISPR的间隔区：细菌通过入侵的噬菌体或质粒的一小段DNA序列整合到自身基因组的重复序列之间，即CRISPR 5
′
端的两个重复序列之间，从而获得高度可变的间隔区域；(2)CRISPR基因座的表达与crRNA的成熟：CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre
‑
crRNA)，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成熟的crRNA；(3)CRISPR/Cas系统对外源遗传物质的切割：成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖核蛋白复合物，crRNA识别外源匹配的DNA序列并与之结合，从而介导核糖核蛋白复合物对外源遗传物质的切割。
[0003]为了简化操作过程并提高编辑效率，常常将crRNA和tracrRNA构建成一个嵌合体sgRNA(small guide RNA)进行表达，即只需要表达sgRNA和Cas9蛋白便可进行基因编辑。目前除了CRISPR/Cas9系统以外，CRISPR/Cpf1系统也常被应用于基因编辑，与CRISPR/Cas9系统不同的是，CRISPR/Cpf1只需要crRNA便可发挥作用，且Cpf1自身就具有RNA酶的活力，可以对未成熟的包含多个crRNA的mRNA序列进行切割加工，因此可以设计一段包含多个crRNA的crRNA阵列，可产生多个具有独立功能的crRNA并引导Cpf1靶向基因组的对应靶点，实现多个位点的同时编辑。
[0004]很多物种都缺少NHEJ途径(即使有活性也较弱)，而HDR途径需要同源模板的参与才能发挥作用，且这两种修复机制之间还会存在竞争关系，这都导致基于上述方式的基因编辑过程致死率较高且编辑效率较低。将Cas9的DNA酶进行失活后，可以得到只能切割一条DNA链的nCas9和无法切割DNA的dCas9。nCas9与dCas9仍然可以在sgRNA的引导下结合到基因组的特定位点，但却不会产生致死的双链断裂。大肠杆菌的tRNA腺苷脱氨酶TadA突变体TadA7.10可以将腺嘌呤(A)脱氨形成肌苷(I)，在DNA水平肌苷会被当作鸟嘌呤(G)进行读码和复制，最终实现A
→
G的转换。因此，可以将TadA7.10融合到nCas9或dCas9的N末端后获得的融合蛋白(dCas9
‑
ABE或nCas9
‑
ABE)可以在sgRNA的引导下实现基因组上特定位点的A
→
G转化，被称为腺嘌呤碱基编辑系统。
[0005]中国专利CN201811613264.9公开了一种CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系
统，实现了单碱基定点替换(A>G)，并将其用于改良水稻稻瘟病广谱抗性，但该系统用于多位点碱基编辑时需要构建多个对应的sgRNA表达框，这不仅增加了构建过程的复杂性，还会由于启动子等元件的重复使用而降低DNA序列的稳定性，且Cas9所识别的位点需要具有NGG(N＝A,T,C,G)的PAM序列，这限制了基于Cas9的胞嘧啶碱基编辑器在基因组上的可操作范围；中国专利CN201811563073.6公开了一种植物碱基编辑方法，包括由核酸酶失活的CRISPR效应蛋白和DNA依赖的腺嘌呤脱氨酶形成的碱基编辑融合蛋白，所述CRISPR效应蛋白是Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶，DNA依赖的腺嘌呤脱氨酶是大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA(ecTadA)的变体，所述变体相对于野生型ecTadA包含一或多组选自以下的突变：1)A106V和D108N；2)D147Y和E155V；3)L84F、H123Y和I156F；4)A142N；5)H36L、R51L、S146C和K157N；6)P48S/T/A；7)A142N；8)W23L/R；9)R152H/P；中国专利201811578853.8公开了一种基于CPF1蛋白的碱基编辑系统，其中，碱基编辑融合蛋白包含DNA切割活性缺失的Cpf1(D917A突变)和脱氨酶，脱氨酶的突变体同上，能够实现靶序列中一或多个C至T或者A至G的取代。上述系统都只使用了目前应用较为广泛的ecTadA的ABE7.9(TadA7.9)和ABE7.10(TadA7.10)突变体，碱基编辑器的性能还需进一步提高。因此，本专利技术旨在寻找一种编辑位点多、编辑窗口大、编辑效率和编辑活性高的腺嘌呤碱基编辑器。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cpf1的腺嘌呤碱基编辑器，克服了现有的A>G腺嘌呤碱基编辑器在基因组上的可操作范围受限，而且在多位点的碱基编辑过程中效率低且操作复杂的问题。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种基因编辑融合蛋白，该基因编辑融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
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4所示的序列之一。其中，SEQ ID NO.2为含有TadA8.20的融合蛋白序列，SEQ ID NO.3为含有TadA8e的融合蛋白序列，SEQ ID NO.4为含有TadA9的融合蛋白序列。
[0008]本专利技术提供了一种基因编辑融合蛋白，该基因编辑融合蛋白可识别TTV作为PAM，其中，V＝A,C,G，该融合蛋白用于基因编辑时，编辑窗口在crRNA的第9个碱基、第7个碱基到第9个碱基之间或第4个碱基到第23个碱基之间，将腺嘌呤碱基编辑为鸟嘌呤。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种腺嘌呤碱基编辑器，该腺嘌呤碱基编辑器包括上述基因编辑融合蛋白和crRNA阵列插入区。crRNA阵列插入区插入的crRNA与DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1相匹配，引导DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1剪切编辑特定靶点。
[0010]进一步地，crRNA阵列插入区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该crRNA阵列插入区两端包含两个正向重复的crRNA把手序列，并在中间插入了两个反向的Eco31I酶切位点，通过酶切连接便可将所需的识别序列或crRNA阵列放置到两个把手序列之间。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑融合蛋白，其特征在于，所述基因编辑融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
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4所示的序列之一。2.一种腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于：所述腺嘌呤碱基编辑器包括权利要求1所述的基因编辑融合蛋白和crRNA阵列插入区。3.根据权利要求2所述的腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于：所述crRNA阵列插入区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求2所述的腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于：所述基因编辑融合蛋白通过诱导型启动子P
grac100
调控表达。5.根据权利要求2所述的腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于：crRNA阵列插入区通过组成型启动子P
veg
调控表达。6.一种枯草芽孢杆菌腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，武耀康，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：