一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开的是一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，包括磁微粒偶联的多克隆抗体、吖啶酯标记的单克隆抗体、猪圆环病毒2型抗原标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液、反应管，本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，与现有的猪圆环病毒2型检测技术相比，本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点。反应时间短等优点。反应时间短等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种试剂盒，更具体一点说，涉及一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，属于兽用疫病检测


技术介绍

[0002]猪圆环病毒病(Porcine circovirus，PCV)是一种近年来倍受关注的广泛流行于世界各地的疾病,它是由猪圆环病毒型引起的一系列疾病的总称。发现猪圆环病毒属圆环病毒科、圆环病毒属，是已知的最小的动物病毒之一。猪圆环2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)具有极高的致病性，目前该病已在我国猪群中广泛流行，给养猪业造成巨大的经济损失，严重危害养猪业发展，需引起高度重视。
[0003]PCV2的基因组全长为1767
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1768bp，含有11个ORF,分别编码1.8
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35.8kD 的蛋白质，ORF1和ORF2是PCV2的两个主要开放性阅读框，编码两种蛋白 ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep)，ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)PCV2的基因组非常小，基因组全长为PCV2为1767
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1768bp，PCV2含有11个ORFs,分别编码1.8
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35.8kD的蛋白质，ORF1和ORF2是PCV2的两个主要开放性阅读框，反向编码两种蛋白ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep)，ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。ORF2编码Cap蛋白(又称核衣壳蛋白)，为病毒的主要结构蛋白，包含病毒主要的抗原表位，因此能够用于PCV2病毒的检测。该蛋白由233个氨基酸组成，分子量约为27.2kD。
[0004]常见的猪圆环病毒2型检测方法有酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法等等。荧光PCR检测方法耗时耗力；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择。该技术与荧光PCR检测方法相比，操作简单，反应时间短，该方法敏感性与精确度好，检测范围很广。

技术实现思路

[0005]为了解决上述现有技术问题，本专利技术提供具有能够解决当前市场上PCV2 诊断试剂存在的成本高、耗时长、精度低等问题等技术特点的一种猪圆环病毒2 型化学发光检测试剂盒。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒设有一个盒体，盒体内装有磁微粒偶联的多克隆抗体、吖啶酯标记的单克隆抗体、猪圆环病毒2型抗原干粉、抗原定标品缓冲溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B，还包括反应管槽、操作说明书槽，所述反应管槽内可拆卸放置有多个反应管，所述操作说明书槽内放置有说明书。
[0008]优选的，单克隆抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO.1:
[0009]1 QYQLEDFSGP GLVASSQSLS ITCTVSGFSL SRYMVHWVRQ PNGKGFSEWL GMIWGGGSDR YNSALKSRLS
[0010]71 IGTDNSSSQV FLKSEDSLQT DDTAMYYCAR DGYYDYAIDY WGQGTSVTVC SER；
[0011]单克隆抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO.2:
[0012]1 DIKSQSPSSM YAMLSWERVT ITCASSDICS YLSWYQLKPW KSSKTLDYYA TSADGVPSRF SASGSGQDYY
[0013]71 LTISSLMSDD TATYYCSE。
[0014]优选的，所述的磁微粒的粒径为0.01
‑
1μm。
[0015]优选的，所述磁微粒偶联的多克隆抗体是采用磁微粒直接与猪圆环病毒2型多克隆体抗体偶联。
[0016]优选的，所述吖啶酯标记的单克隆抗体是采用吖啶酯直接与猪圆环病毒2型单克隆体抗体偶联。
[0017]优选的，所述抗原标准品缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液含有0.5
‑
5.0％的牛血清白蛋白，通过在所述磷酸盐缓冲溶液中添加猪圆环病毒 2型抗原干粉后能够制备系列浓度梯度的校准品溶液。
[0018]优选的，所述化学发光预激发液A由浓硝酸和双氧水混合组成，其中硝酸浓度为0.05
‑
2.5mol/L，双氧水质量分数为0.05
‑
5％，所述化学发光激发液B由氢氧化钠和曲拉通X
‑
100混合组成，其中氢氧化钠的浓度为0.05
‑
1.0mol/L，曲拉通X
‑
100 的浓度为0.05
‑
2.0mol/L。
[0019]优选的，所述的清洗液的pH值为7.0
‑
9.0，其中含有浓度为5.0
‑
50.0mmol/L的磷酸缓冲溶液，含有质量分数为0.01
‑
0.25％的吐温20。
[0020]优选的，所述磁微粒偶联的多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0021]步骤1)取1mg羧基磁微粒于1.0mL离心管中，加入0.1
‑
0.5mL的0.1mol/L 的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入0.5
‑
1.0mL的MES(pH值为6.0)的缓冲液，涡旋；
[0022]步骤2)加入15μg的多克隆抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育20min；
[0023]步骤3)加入10μL浓度为10mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2h；
[0024]步骤4)离心后弃上清液，加入200μL的清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包括TBS以及0.05％吐温20，洗涤3次；
[0025]步骤5)用含1％牛血清白蛋白的缓冲液进行封闭，封闭6h，将该磁微粒重悬后置于于2
‑
8℃保存。
[0026]优选的，吖啶酯标记的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0027]步骤1)称取1.6mg的吖啶酯NSP
‑
DMAE
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NHS，溶于无水DMSO中，配成 6.5mmol/L的母液；
[0028]步骤2)在避光环境下，将5μL的单克隆抗体与195μL的吖啶酯母液混合，室温下反应1h，加入10g/L赖氨酸100μL，继续反应10min，使标记反应终止；
[0029]步骤3)将标记后的溶液注入Sephadex G
‑
25脱盐柱，用0.1mol/L的PBS 进行洗涤；
[0030]步骤4)用色谱仪检测蛋白，在280nm下检测蛋白浓度，当色谱仪出现明显的蛋白峰值时，收集流出液；
[0031]步骤5)流出液中添加1％的牛血清白蛋白后冷冻保存。
[0032]优选的，猪圆环病毒2型抗原干粉与定标品缓冲溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒设有一个盒体(1)，盒体(1)内装有磁微粒偶联的多克隆抗体(2)、吖啶酯标记的单克隆抗体(3)、猪圆环病毒2型抗原干粉(4)、抗原定标品缓冲溶液(5)、清洗液(6)、化学发光预激发液A(7)、化学发光激发液B(8)，还包括反应管槽(9)、操作说明书槽(10)，所述反应管槽(9)内可拆卸放置有多个反应管，所述操作说明书槽(10)内放置有说明书。2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO.1:1 QYQLEDFSGP GLVASSQSLS ITCTVSGFSL SRYMVHWVRQ PNGKGFSEWL GMIWGGGSDR YNSALKSRLS71 IGTDNSSSQV FLKSEDSLQT DDTAMYYCAR DGYYDYAIDY WGQGTSVTVC SER；单克隆抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO.2:1 DIKSQSPSSM YAMLSWERVT ITCASSDICS YLSWYQLKPW KSSKTLDYYA TSADGVPSRF SASGSGQDYY71 LTISSLMSDD TATYYCSE。3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒的粒径为0.01
‑
1μm。4.根据权利要求1或2或3所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述磁微粒偶联的多克隆抗体是采用磁微粒直接与猪圆环病毒2型多克隆体抗体偶联。5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述吖啶酯标记的单克隆抗体是采用吖啶酯直接与猪圆环病毒2型单克隆体抗体偶联。6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述抗原标准品缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液含有0.5
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5.0％的牛血清白蛋白，通过在所述磷酸盐缓冲溶液中添加猪圆环病毒2型抗原干粉后能够制备系列浓度梯度的校准品溶液。7.根据权利要求1或2或3或5或6所述的一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光预激发液A由浓硝酸和双氧水混合组成，其中硝酸浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒建洪，陶思锐，查银河，何玉龙，冯华鹏，张稳涛，余晓玉，
申请(专利权)人：浙江洪晟生物科技股份有限公司浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：