一种逆转非小细胞肺癌耐药性的基因药物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼耐药的基因药物，本发明专利技术将人LMNA基因全长编码区cDNA插入到病毒表达载体，再利用病毒感染非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株的方法过表达lamin A/C蛋白，增加lamin A/C蛋白在非小细胞肺癌中的表达，所得到的病毒载体得以高效、持续和稳定的表达lamin A/C蛋白。本发明专利技术所构建的LMNA病毒载体可以逆转非小细胞肺癌细胞对厄洛替尼的耐药性，因此具有广阔的应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种逆转非小细胞肺癌耐药性的基因药物


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼获得性耐药的基因药物。

技术介绍

[0002]非小细胞肺癌（NSCLC）是临床最常见的恶性肿瘤之一，占肺癌总数的80%以上。经手术、放疗和化疗等综合治疗后，其5年总生存率仅12%~15%，严重影响人类的生存质量和期望寿命。由于治疗的持续性和高精确性，肺癌不仅给个人造成巨大经济负担，同时给社会生产力带来严重损失，影响国家经济发展。因此，深入研究NSCLC发病及耐药机制并发展新的治疗策略对人类健康和国家经济发展都具有极其重要的意义。
[0003]厄洛替尼是一种靶向表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，与传统治疗药物（如细胞毒类药物）相比具有更强的针对性，可以增强对肿瘤的杀伤作用，并减少对正常细胞的毒副作用，对EGFR突变的晚期NSCLC患者非常有效，但是多数患者在使用厄洛替尼一段时间后（大约1年左右）会出现疾病的再次进展，根本原因是由于肺癌细胞对厄洛替尼产生了耐药性。目前已发现的耐药机制主要包括：（1）EGFR基因的二次突变（T790M突变）；（2）c
‑
MET原癌基因扩增；（3）K
‑
Ras基因突变；（4）PTEN功能丧失；（5）组织学转化。非小细胞肺癌EGFR
‑
TKI获得性耐药机制涉及多基因、多途径的复杂调控过程，部分耐药机制尚不明确。
[0004]核纤层蛋白A/C（Lamin A/C）由人类基因LMNA基因编码的蛋白质，可以直接与核染色质作用，或调节转录因子活性调控基因表达，在细胞信号转导、周期调控、氧化应激及DNA损伤反应等生理过程中发挥重要作用。核纤层蛋白在癌组织中的异常定位或错误表达可能成为癌症的生物靶标之一。但目前LMNA基因与肿瘤细胞的耐药性研究还不得而知，同时开发其他逆转耐药性药物克服临床治疗非小细胞肺癌厄洛替尼耐药性迫在眉睫。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼获得性耐药的基因药物。
[0006]本专利技术另一目的在于提供上述基因药物的制备方法。
[0007]本专利技术第三目的在于提供人LMNA基因的新应用。
[0008]本专利技术目的按如下技术方案实现的：一种逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼获得性耐药的基因药物，其特征在于，所述基因药物为携带LMNA基因的病毒载体，所述LMNA基因序列为SEQ ID NO.1 所示，所述LMNA基因受CMV启动子的调控。本专利技术基因药物可大量、高效地表达LaminA/C蛋白。
[0009]为了进一步实现更稳定地表达，上述病毒载体优选采用pLVX
‑
Puro载体。
[0010]LMNA基因在制备用于逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼耐药性的药物中的应用。
[0011]具体地，上述应用中，上述LMNA基因序列为SEQ ID NO.1 所示。
[0012]进一步，上述应用中，为了更高效地表达，上述LMNA基因受CMV启动子的调控。
[0013]更进一步，为了更高效稳定、靶向地表达，上述应用中，上述LMNA基因是与病毒载体相连，所述病毒载体优选采用pLVX
‑
Puro载体。
[0014]上述基因药物的构建方法，其特征在于，按如下步骤进行：1、病毒载体LMNA的构建根据LMNA基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1序列设计引物，上游引物LMNA
‑
F 核苷酸序列如SEQ ID NO.2，下游引物LMNA
‑
R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3，通过PCR扩增方式将酶切位点引入LMNA基因两端，PCR条件为：95℃ 预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2min，共35个循环； 72℃ 终延伸5min。
[0015]LMNA基因受CMV启动子的调控，同时对LMNA基因片段和pLVX
‑
Puro载体进行XhoI和BamHI双酶切，回收 LMNA基因片段和pLVX
‑
Puro载体片段，两片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选、测序鉴定获得pLVX
‑
Puro
‑
LMNA载体；应用宝生物公司三质粒包装系统（pMD.2G、psPAX2、pLVX
‑
Puro
‑
LMNA）制备慢病毒，将HEK293T细胞培养在100mm皿中，待细胞长到60
‑
70%时可进行转染;转染体系为：取1ml DMEM无血清培养基加入2.5μg pMD.2G、7.5μg psPAX2、10μg pLVX
‑
Puro
‑
LMNA，混匀后加入20μl PEI （2mg/ml）溶液，与质粒载体混匀，室温静置5min，缓慢滴加到培养皿中，十字交叉混匀，培养箱中培养48h （无需更换培养基），吸取上清，4000rpm离心5min，取上清，制得病毒载体LMNA;2、细胞株中核纤层蛋白Lamin A/C表达检测通过浓度梯度法建立HCC827.ER耐药细胞株，利用western blot法检测亲本HCC8287和耐药细胞HCC827.ER细胞裂解物中的lamin A/C蛋白表达情况，用载体LMNA病毒对HCC827.ER细胞进行感染，感染48h后采用免疫荧光技术检测细胞中lamin A/C蛋白的表达；3、MTT法检测各细胞对厄洛替尼的敏感性；4、细胞骨架染色后光学显微镜观察形态与细胞骨架；5、细胞计数仪扫描LMNA基因可以抑制肿瘤细胞克隆的形成；6、荧光显微镜观察LMNA基因抑制细胞增殖、迁移和侵袭；7、Western blot检测LMNA基因对细胞周期蛋白的调控。
[0016]本专利技术获得的有益效果：本专利技术提供了一种逆转非小细胞肺癌厄洛替尼获得性耐药的基因药物。首先，本专利技术首次发现对厄洛替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株中LMNA基因的甲基化明显，从而降低lamin A/C蛋白表达。并基于此科学现象本专利技术采用病毒载体携带人LMNA基因增加lamin A/C蛋白在非小细胞肺癌中的表达，所得到的病毒载体得以高效、持续和稳定的表达lamin A/C蛋白，同时本专利技术基因药物可更好地进入肿瘤细胞内部实现靶向表达。本专利技术所构建的LMNA病毒载体可以逆转非小细胞肺癌细胞对厄洛替尼的耐药性，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
[0017]图1：载体构建电泳图，M：Tran8K DNA marker；Lane1：LMNA基因PCR片段其大小1995bp；Line2：pLVX
‑
Puro
‑
LMNA载体BamHI与XhoI双酶切，载体片段大小约8000bp，酶切
LMNA大小1995bp与PCR片段一致。
[0018]图2：亲本株HCC827与耐药株HCC827.ER核纤层蛋白lamin A/C表达差异，A. western blot检测HCC827本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼获得性耐药的基因药物，其特征在于：所述基因药物为携带LMNA基因的病毒载体，所述LMNA基因序列为SEQ ID NO.1 所示，所述LMNA基因受CMV启动子的调控。2.如权利要求1所述的基因药物，其特征在于：所述病毒载体为pLVX
‑
Puro载体。3. LMNA基因在制备用于逆转非小细胞肺癌对厄洛替尼耐药性的药物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述LMNA基因序列为SEQ ID NO.1 所示。5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述LMNA基因受CMV启动子的调控。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述LMNA基因是与病毒载体相连，所述病毒载体为pLVX
‑
Puro载体。7.如权利要求1或2所述基因药物的构建方法，其特征在于，按如下步骤进行：所述基因药物的构建主要包括病毒载体LMNA的构建。8.如权利要求书7所述基因药物的构建方法，其特征在于：所述病毒载体LMNA的构建按以下步骤：根据LMNA基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1序列设计引物，上游引物LMNA
‑
F 核苷酸序列如SEQ ID NO.2，下游引物LMNA
‑
R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3；通过PCR扩增方式将酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡春生，庄多瀚，唐艳，黄玖红，杨东林，
申请(专利权)人：重庆文理学院，
类型：发明
国别省市：