一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂盒中的应用。首先，本发明专利技术意外发现，牛流行热病毒GNS

【技术实现步骤摘要】
一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用


[0001]本专利技术属于牛流行热病毒检测
，具体涉及一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]牛流行热(bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性非接触性传染病。因为该病的流行特点，它又被称为三日热、暂时热、僵硬病等。该病会引起奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行及瘫痪，对养殖业造成重大经济损失。目前，该病感染动物包括黄牛、奶牛、水牛、牦牛、白牦牛等。
[0003]目前在牛流行热流行地区，主要利用疫苗接种防控该病。前期我们建立了以G蛋白为检测抗原的ELISA诊断方法(ZL 201410244271.1)可用于免疫水平监测，但在疫苗接种牛或自然感染牛均存在G蛋白抗体，因此基于G蛋白无法区别牛自然感染BEFV或BEF疫苗免疫产生的抗体，在推广应用中发现有疫苗受种史的疑似病牛无法利用G蛋白抗体ELISA进行诊断。目前已知BEFV编码N、P、M、G和L、α1、α2、α3、β、γ等蛋白，但尚不清楚病毒感染和疫苗免疫动物产生抗体的差别，可用于甄别自然感染的病毒抗原成为鉴别诊断的瓶颈。而且经前期研究发现，BEFV编码的N、P、M、α1、γ和L蛋白不能区分BEFV自然感染牛和疫苗接种牛，无法用于牛流行热病毒自然感染抗体的检测。

技术实现思路
/>[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术通过筛选，获得可用于甄别自然感染的病毒抗原，提出一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用。具体包括以下内容：
[0005]第一方面，本专利技术提供了牛流行热病毒蛋白在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用，所述牛流行热病毒蛋白选自牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白中的至少一种；所述GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
5所示。
[0006]优选地，所述牛流行热病毒蛋白由牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成。
[0007]优选地，所述牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种牛流行热病毒蛋白组合物，所述牛流行热病毒蛋白组合物由牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成；所述GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
5所示。
[0009]优选地，所述牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的
比例为1：1：2：2：2。
[0010]第三方面，本专利技术提供了上述第二方面所述的牛流行热病毒蛋白组合物在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用。
[0011]第四方面，本专利技术提供了一种上述第二方面所述的牛流行热病毒蛋白组合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
[0012](1)分别以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT
‑
PCR，扩增GNS
‑
N端蛋白编码区、GNS
‑
C端蛋白编码区、α2蛋白编码区、α3蛋白编码区和β蛋白编码区，分别将对应的编码区克隆至原核表达载体，转化表达菌株，经过抗性筛选后进行培养发酵，纯化获得重组GNS
‑
N端蛋白、重组GNS
‑
C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白；
[0013](2)将获得的重组GNS
‑
N端蛋白、重组GNS
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C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白混合即得牛流行热病毒蛋白组合物。
[0014]第五方面，本专利技术提供了一种牛流行热病毒自然感染抗体检测ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：酶标板、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜和血清稀释液；其中，所述酶标板上包被有牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白中的至少一种；所述GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
5所示。
[0015]优选地，所述酶标板上包被有牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
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C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物。
[0016]优选地，所述牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
[0017]优选地，所述酶结合物为兔抗牛酶标二抗。
[0018]优选地，所述阳性对照为牛流行热病毒感染牛血清；所述阴性对照为未感染牛流行热病毒的牛血清；所述显色液为TMB显色液；所述洗涤液为PBST；所述终止液为H2SO4。
[0019]本专利技术的有益效果是：首先，本专利技术提供的牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
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C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白及其组合物仅与BEFV感染牛血清反应但与疫苗接种牛血清无交叉反应，解决了现有技术无法区分牛流行热病毒野毒感染于疫苗免疫动物的技术难题；其次，利用本专利技术提供的牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物为复合抗原，实现自然感染牛的α2、α3、β和GNS抗体同时检测，有效避免由于窗口期造成的利用单一抗原进行检测可能存在的漏检问题。
附图说明
[0020]图1BEFV重组GNS
‑
N端蛋白表达及纯化；其中泳道1为Marker，自上而下分别为180kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD、10kD；泳道2为诱导前；泳道3为1mM IPTG诱导表达后3h；泳道4为1mM IPTG诱导表达后4h；泳道5为1mM IPTG诱导表达后5h；泳道6为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.牛流行热病毒蛋白在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述牛流行热病毒蛋白选自牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白中的至少一种；所述GNS
‑
N端蛋白、GNS
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C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
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5所示。2.一种牛流行热病毒蛋白组合物，其特征在于，所述牛流行热病毒蛋白组合物由牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成；所述GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
5所示。3.如权利要求2所述的牛流行热病毒蛋白组合物，其特征在于，所述牛流行热病毒GNS
‑
N端蛋白、GNS
‑
C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。4.如权利要求2或3所述的牛流行热病毒蛋白组合物在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用。5.如权利要求2或3所述的牛流行热病毒蛋白组合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)分别以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT
‑
PCR，扩增GNS
‑
N端蛋白编码区、GNS
‑
C端蛋白编码区、α2蛋白编码区、α3蛋白编码区和β蛋白编码区，分别将对应的编码区克隆至原核表达载体，转化表达菌株，经过抗性筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：高闪电，何辰香，田占成，独军政，刘军龙，王锦明，关贵全，刘光远，罗建勋，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：