【技术实现步骤摘要】
肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒及其使用方法
[0001]本专利技术属于蛋白质检测
,特别是涉及肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒以及肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的使用方法。
技术介绍
[0002]肉豆蔻酰化属于较大分子量的蛋白翻译后修饰类型,在NMT的催化下,蛋白N端的甘氨酸与肉豆蔻酸发生不可逆反应,形成结合。NMT与一组特定靶蛋白N端氨基酸残基结合,此处残基已经被鉴定为一种典型的基序,尽管存在某些氨基酸变异,也可能会阻止或促使其他部分发生该修饰。NMT的另外一个底物是肉豆蔻酰辅酶a硫酯,由细胞内的酰基辅酶a合成酶生产。在真核生物中,豆蔻酸盐是通过共翻译引入的,当蛋白水解消化后产生一个新的N端甘氨酸,脂化促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用,以及与转运和信号转到相关的膜蛋白之间的相互关联。
[0003]采用酶标记和生物化学反应标记,在体内和体外进行化学反应最大的挑战是化学反应的多样性,与目前所了解的生命系统中发生正交生物反应的官能团少之又少,这是阻碍此领域研究的发生的一个障碍,生命系统中发现的可发生反应的官能团也大都在反应体系中比较稳定。蛋白酰基化包括氘标记的肉豆蔻酸在内,均可通过SDS
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PAGE分离蛋白质后进行放射自显影,然而为了安全和成本考虑,放射自显影可能需要数小时甚至更长的时间,相比较之下,凝胶内荧光成像只需要几秒钟,而且成本很低。荧光蛋白可以通过遗传方法被整合到感兴趣的蛋白中,但是这些蛋白质体积通常较大(通常>10Kda),这意味这可能会干扰蛋白质的功能。
[000 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒,其特征在于,包括:第一溶液:为探针,由0.05M的十四炔酸与0.11g至10ml的二甲基亚砜分装
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20℃冻存;第二溶液:为裂解液,另需试剂0.1M的苯甲基磺酰氟以及BCA蛋白浓度测定试剂盒;第三溶液:为标记缓冲液;第四溶液:为10mM的叠氮重氮生物素;第五溶液:为50mM硫酸铜与0.08g至10ml的水构成;第六溶液:为50mM的三(2
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羧乙基)膦与2.8665g
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10ml的水构成;第七溶液:为封闭液,由2mM的叔丁基三氯乙酰亚胺酯与0.01g
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10ml的二甲基亚砜构成,分装
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20℃冻存;第八溶液:为0.5M乙二胺四乙酸以及1.68g
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10ml水构成。2.根据权利要求1所述的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:S01、细胞共培养标记蛋白:将12ul的第一溶液加入50ul 0.01M的氢氧化钠混合加热70℃,5分钟充分溶解,与12ml培养基混合,0.22um滤膜过滤后培养细胞4小时,阴性对照用二甲基亚砜代替;药物处理16小时,收集细胞到1.5ml离心管中,用冷磷酸盐缓冲液清洗两次;S02、提取蛋白:细胞离心管中,加入500ul的第二溶液,10ul 0.1M的苯甲基磺酰氟,300瓦功率下超声,超声5秒且停5秒,持续两分钟,12000g离心上清;使用BCA法测定蛋白浓度,根据实验需要取适量蛋白进行IP处理;S03、CM沉淀:IP后的蛋白取100ug用第二溶液补足体积至200ul,加入600ul甲醇,150ul氯仿,400ul二次蒸馏水,震荡混匀,13000rpm离心5分钟,取沉淀加入450ul甲醇,13000rpm...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵淑娟,崔蕴博,
申请(专利权)人:苏州柯茂生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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