本发明专利技术提供了一种农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法，该方法采用了特定配方的筛选培养基，不仅能够适用于甜叶菊转基因抗性愈伤组织的抗性筛选和诱导培养，还能够适用于后续的抗性愈伤组织分化出芽的过程，获得了较佳的抗性愈伤组织出芽率，构建了更为高效的农杆菌介导的甜叶菊遗传转化体系。的甜叶菊遗传转化体系。的甜叶菊遗传转化体系。
【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法
[0001]本专利技术涉及一种农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法，属于植物生物技术的植物基因工程领域。
技术介绍
[0002]甜叶菊(Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl.)是菊科、甜叶菊属多年生草本植物。甜叶菊叶片中所富含的甜叶菊糖苷是一种低热量、无毒副作用、高甜度的天然甜味剂，是食品及药品工业的原料之一。我国是甜叶菊原料和甜叶菊糖苷的最大的出口国之一，甜叶菊已成为我国增加农民收入的重要经济作物。
[0003]本领域技术人员希望通过转基因育种的手段，选育出优良的、甜叶菊糖苷含量高的甜叶菊新品种。
[0004]目前常规的植物遗传转化方法主要包括农杆菌介导法、基因枪转化法及花粉管通道法、蘸花法等其他方法；其中，农杆菌介导法简单易行、经济高效，使用最为广泛，是本领域利用分子育种技术进行性状改良的重要手段。
[0005]现有技术中，关于农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法的研究报道，普遍存在外植体受农杆菌污染严重、外植体成活率低、转化率低、转化周期长、愈伤出芽率低、不定芽分化效率低等技术问题，尤其是愈伤出芽率低、不定芽分化效率低的问题严重制约了转基因抗性愈伤组织的出芽率和甜叶菊植株的再生。
[0006]因此，本领域技术人员希望在现有的农杆菌介导的遗传转化方法的基础之上进行改进，构建更为高效的农杆菌介导的甜叶菊遗传转化体系及其方法。
技术实现思路
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术一方面提供了一种农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法，其中，
[0008]所述甜叶菊遗传转化方法包括以下步骤：
[0009]步骤1)，获取甜叶菊叶片外植体作为遗传转化受体；
[0010]步骤2)，农杆菌侵染和共培养：将含有卡那霉素抗性基因和目的基因的重组农杆菌侵染所述步骤1)的遗传转化受体，得到侵染后的外植体；去除所述侵染后的外植体表面残余菌液后，再进行共培养；
[0011]步骤3)，筛选培养：将所述步骤2)获得的共培养后的外植体转移至筛选培养基进行暗培养获得抗性愈伤组织；再继续暗培养所述抗性愈伤组织直至其分化出不定芽；
[0012]所述筛选培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.4～1.6mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.4～0.6mg/L的激动素、0.4～0.6mg/L的吲哚
‑3‑
乙酸、80～110mg/L羧苄西林和7～9mg/L的卡那霉素；
[0013]步骤4)，生根培养：切下所述步骤3)获得的不定芽进行生根培养，获得转基因甜叶菊植株。
[0014]在本专利技术的一个优选实施方案中，在所述步骤3)中，将所述步骤2)获得的共培养后的外植体转移至筛选培养基上暗培养3
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4周后，切下抗性愈伤组织，再转移至不定芽分化培养基上继续暗培养直至所述抗性愈伤组织分化出不定芽。
[0015]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述不定芽分化培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.4～1.6mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.4～0.6mg/L的激动素、0.4～0.6mg/L的吲哚
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乙酸、80～110mg/L羧苄西林和7～9mg/L的卡那霉素。
[0016]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基的配方中，所述6
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苄氨基嘌呤的含量为1.40、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59或者1.60mg/L。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基的配方中，所述激动素的含量0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59或者0.60mg/L。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基的配方中，所述吲哚
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乙酸的含量为0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59或者0.60mg/L。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基的配方中，所述羧苄西林的含量为90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或者110mg/L。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基的配方中，所述卡那霉素的含量为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或者9.0mg/L。
[0021]在本专利技术的一个优选实施方案，所述筛选培养基和/或所述不定芽分化培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.5mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.5mg/L的激动素、0.5mg/L的吲哚
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乙酸、100mg/L羧苄西林和8mg/L的卡那霉素。
[0022]在本专利技术的一个优选实施方案，所述甜叶菊叶片外植体取自甜叶菊植株苗的上位叶。
[0023]在本专利技术的另一个优选实施方案，在所述步骤2)中，所述重组农杆菌为根癌农杆菌，所述农杆菌侵染液的OD
600
落入0.4
‑
0.6的范围，侵染时间为3～12分钟；并且，所述共培养的时间为40～55小时。
[0024]优选的，在所述步骤2)中，所述根癌农杆菌为菌株EHA105、LBA4404、GV3101或AGL1。
[0025]优选的，所述步骤4)中，所述步骤4)中，所述生根培养所采用的培养基配方为1/2MS+90～110mg/L羧苄西林。
[0026]本专利技术另一方面提供了一种应用于甜叶菊遗传转化的筛选培养基，其中，所述筛选培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.4～1.6mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.4～0.6mg/L的激动素、0.4～0.6mg/L的吲哚
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乙酸、80～110mg/L羧苄西林和7～9mg/L的卡那霉素。
[0027]优选的，所述筛选培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.5mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.5mg/L的激动素、0.5mg/L的吲哚
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乙酸、100mg/L羧苄西林和8m本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的甜叶菊遗传转化方法，其特征在于：所述甜叶菊遗传转化方法包括以下步骤：步骤1)，获取甜叶菊叶片外植体作为遗传转化受体；步骤2)，农杆菌侵染和共培养：将含有卡那霉素抗性基因和目的基因的农杆菌侵染所述步骤1)的遗传转化受体，得到侵染后的外植体；去除所述侵染后的外植体表面残余菌液后，再进行共培养；步骤3)，筛选培养：将所述步骤2)获得的共培养后的外植体转移至筛选培养基进行培养获得抗性愈伤组织；再继续培养所述抗性愈伤组织直至其分化出不定芽；所述筛选培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.4～1.6mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.4～0.6mg/L的激动素、0.4～0.6mg/L的吲哚
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乙酸、80～110mg/L羧苄西林和7～9mg/L的卡那霉素；步骤4)，生根培养：切下所述步骤3)获得的不定芽进行生根培养，获得转基因甜叶菊植株。2.如权利要求1所述的甜叶菊遗传转化方法，其特征在于：在所述步骤3)中，将所述步骤2)获得的共培养后的外植体转移至筛选培养基上暗培养3
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4周后，切下抗性愈伤组织，再转移至不定芽分化培养基上继续暗培养直至所述抗性愈伤组织分化出不定芽。3.如权利要求2所述的甜叶菊遗传转化方法，其特征在于：所述不定芽分化培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.4～1.6mg/L的6
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苄氨基嘌呤、0.4～0.6mg/L的激动素、0.4～0.6mg/L的吲哚
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乙酸、80～110mg/L羧苄西林和7～9mg/L的卡那霉素。4.如权利要求1所述的甜叶菊遗传转化方法，其特征在于：所述筛选培养基为含有蔗糖的固体MS培养基，且其配方还含有1.5mg/L的6
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【专利技术属性】
技术研发人员：张虹，陈任，虎娟，路国栋，刘慧，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：
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