本发明专利技术公开了一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，该方法包含：(1)肉质花梗外植体的选取；(2)外植体的灭菌：将所述肉质花梗清洗并灭菌；(3)外植体的预培养；(4)外植体的浸染；(5)外植体与菌液共培养；(6)外植体延迟培养：(7)外植体筛选培养；(8)抗性芽的生根培养；(9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为西兰花遗传转化阳性苗。本发明专利技术的方法，肉质花梗能在较短时间内再生出芽，遗传转化植株阳性率为22～25％，转化所需时间短，转化结果稳定，试验可重复性高。复性高。复性高。
【技术实现步骤摘要】
一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法
[0001]本专利技术涉及一种西兰花高效遗传转化方法，具体涉及一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法。
技术介绍
[0002]西兰花(Brassica oleracea L.var.italica)是十字花科芸薹属甘蓝种中以由花蕾、花梗、肉质花梗和部分茎组成的花球为食用产品的一个变种，因其营养丰富且富含萝卜硫素而深受人们的青睐。随着全球变暖，反常天气越来越影响西兰花田间生产。研究培育抗病虫害、耐高温或严寒、耐旱等西兰花品种对农业安全生产极为重要。以农杆菌介导的遗传转化技术是外源优异基因的快速转入和靶标内源基因定点突变的重要手段，也是基因功能验证中极为重要的一个环节。因此，建立西兰花高效的遗传转化方法，对西兰花分子育种及基因功能研究都具有重要意义。
[0003]目前，西兰花遗传转化成功的报道较少，并且都存在转化效率较低，实验可重复性较差等问题。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，解决了西兰花遗传转化的问题，肉质花梗能在较短的时间内再生出芽，遗传转化植株阳性率为22～25％，转化所需时间短，转化结果稳定，试验可重复性高。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，该方法包含：
[0006](1)肉质花梗外植体的选取：将成熟西兰花的花球去除上部花蕾，选取横径在0.3～1.8cm的肉质花梗作为外植体；对于外植体，若外植体横径小于 0.3cm，外植体太嫩，对农杆菌的耐受能力弱，并且切口与浸染液的接触面积太小，显著降低遗传转化阳性率；而外植体横径大于1.8cm，切口面积太大，培养过程中会产生大量的醌类物质，使切口褐化加速，显著降低芽再生效率。因此，横径在0.3～1.8cm的花梗外植体，具有较高的芽再生能力，同时对农杆菌的耐受能力较强(而且农杆菌浸染20～30min时，外植体褐化程度很低)，最适合于农杆菌介导的遗传转化；
[0007](2)外植体的灭菌：将所述肉质花梗清洗并灭菌；
[0008](3)外植体的预培养：将灭菌后的肉质花梗吸干表面水分，并切除肉质花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～1.5cm的小段，25℃下在外植体预培养基中预培养3～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6
‑
BA、0.01～0.05mg/L NAA、0.4～0.5mg/LTrans
‑
ZT，pH为5.6～6.0；
[0009](4)外植体的浸染：将预培养的外植体置于外植体浸染液中进行浸染；其中，所述外植体浸染液的配制，包含：将构建有目的基因载体pCambia1301 的农杆菌菌株GV3101于28℃震荡培养过夜至菌液OD
600
为0.6～1.0，菌液离心，弃上清，用相同体积的无菌MS
‑
蔗糖
溶液悬浮，添加终浓度为20mg/L 的乙酰丁香酮，获得外植体浸染液；其中，所述无菌MS
‑
蔗糖溶液包含：MS 液体培养基和20g/L蔗糖；所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010](5)外植体与菌液共培养：将经过浸染的外植体表面的液体吸干，将外植体共培养基表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体放置在滤纸上，在黑暗条件下共培养3d；其中，所述外植体共培养基包含：MS培养基、30 g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6
‑
BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/L Trans
‑
ZT，pH为5.6～6.0；共培养的培养基表层要平铺无菌滤纸，可以有效降低外植体的污染率，共培养阶段是农杆菌侵染外植体切口细胞的重要阶段，菌在干燥环境下的活力会大大降低甚至死亡，高湿度有利于保持农杆菌的活性，提高侵染阳性率，所以共培养基中琼脂的浓度要比其他类型培养基小，这样培养基中的含水量较大；本专利技术能够在较长的时间(3d)进行农杆菌侵染，但又不会对外植体损伤，能够提高再生植株的阳性率；
[0011](6)外植体延迟培养：将经过共培养的外植体，转移至外植体延迟培养基中，在25℃延迟培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体延迟培养基包含：MS培养基、蔗糖30g/L、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6
‑
BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans
‑
ZT、300mg/L特美汀，pH为5.6～6.0；
[0012](7)外植体筛选培养：将经过延迟培养的外植体转移至外植体筛选培养基中，在25℃进行筛选培养，光照时间为16h/d，每隔10～15d将外植体转移至新的外植体筛选培养基上，直至长出抗性芽；其中，所述外植体筛选培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.5～2mg/L 6
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BA、0.01～0.05 mg/LNAA、300mg/L特美汀和5～50mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；
[0013](8)抗性芽的生根培养：将再生的抗性芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养至长出根；其中，所述芽生根培养基包含：MS培养基、 0.05～0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、300mg/L特美汀和5mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；
[0014](9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为西兰花遗传转化阳性苗；其中，所述PCR，以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，采用的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，PCR产物的条带在658bp处，则结果为阳性；所述GUS染色，叶片白色背景上有蓝色小点或蓝色为阳性。
[0015]优选地，所述西兰花选择植株和花球生长健康的西兰花。
[0016]优选地，所述肉质花梗灭菌采用2～4％次氯酸钠溶液。
[0017]优选地，所述肉质花梗灭菌：将肉质花梗切成5cm以内的小段采用2～4％次氯酸钠溶液灭菌，并采用无菌水清洗。
[0018]优选地，所述肉质花梗灭菌时间为10～15min。
[0019]优选地，所述外植体的浸染，浸染的时间为10～30min。
[0020]优选地，所述PCR反应体系为：模板、2
×
PCRmix、上游引物、下游引物和水。
[0021]优选地，所述PCR反应程序为：94℃，3min；94℃30s，55℃15s，72℃ 15s，30个循环；72℃延伸7min，16℃保持。
[0022]优选地，所述GUS染色，为：取PCR检测阳性植株的叶片，加入GUS 染色工作液使其完全浸没叶片，置于抽真空罐中抽真空5min，然后于30℃保温2h；将叶片转入70％乙醇中脱
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包含：(1)肉质花梗外植体的选取：将成熟西兰花的花球去除上部花蕾，选取横径在0.3～1.8cm的肉质花梗作为外植体；(2)外植体的灭菌：将所述肉质花梗清洗并灭菌；(3)外植体的预培养：将灭菌后的肉质花梗吸干表面水分，切除肉质花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～1.5cm的小段，25℃下在外植体预培养基中预培养3～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6
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BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans
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ZT，pH为5.6～6.0；(4)外植体的浸染：将预培养的外植体置于外植体浸染液中进行浸染；其中，所述外植体浸染液的配制，包含：将构建有目的基因载体pCambia1301的农杆菌菌株GV3101于28℃震荡培养过夜至菌液OD
600
为0.6～1.0，菌液离心，弃上清，用相同体积的无菌MS
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蔗糖溶液悬浮，添加终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮，获得外植体浸染液；其中，所述无菌MS
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蔗糖溶液包含：MS液体培养基和20g/L蔗糖；所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(5)外植体与菌液共培养：将经过浸染的外植体表面的液体吸干，在外植体共培养基表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体放置在滤纸上，在黑暗条件下共培养3d；其中，所述外植体共培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6
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BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans
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ZT，pH为5.6～6.0；(6)外植体延迟培养：将经过共培养的外植体，转移至外植体延迟培养基中，在25℃延迟培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体延迟培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L6
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BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans
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ZT、300mg/L特美汀，pH为5.6～6.0；(7)外植体筛选培养：将经过延迟培养的外植体转移至外植体筛选培养基中，在25℃进行筛选培养，光照时间为16h/d，每隔10～15d将外植体转移至新的外植体筛选培养基上，直至长出抗性芽；其中，所述外植体筛选培养基包含：M...
【专利技术属性】
技术研发人员：虞慧芳，顾宏辉，盛小光，王建升，沈钰森，赵振卿，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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