一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化的方法，属于植物组培技术和植物转基因技术领域，所述方法包括获得羊草组培无菌愈伤组织、冻融法转化农杆菌感受态、活化根癌农杆菌、侵染羊草愈伤组织并共培养、植物转化材料的筛选培养、分化筛选培养基及培养条件和生根培养基及培养条件。本发明专利技术实现了添加生长素促进羊草再生效率的提高，获得具有转基因的再生植株。植株。植株。

【技术实现步骤摘要】
一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物组培技术和植物转基因
，具体地涉及一种诱导羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)种子产生愈伤组织，并以这些愈伤组织作为根癌农杆菌侵染对象，成功地建立了羊草的遗传转化体系。

技术介绍

[0002]羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)禾本科赖草属优质牧草及生态草，又称碱草，其耐盐能力强，可生长在盐碱地(pH8.5～11.5)上，是非盐生植物中耐盐性最高的物种之一，为异源四倍体C3植物，是典型的无性系根茎禾草，被誉为“禾本科牧草之王”，是我国比较有优势的生物资源。羊草不仅具有营养价值高、产量高、粗蛋白含量高、适口性好、叶量多等特性，而且具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐瘠薄、耐牧、抗逆性强，适应性广等优点，在改善我国北方草原生态环境、发展草原畜牧业方面发挥着重要作用，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。
[0003]近年来，由于荒漠化加剧导致的自然环境越来越恶劣，加之羊草本身具有的“三低”的(即结实率低、出苗率低、产草量低)问题，严重影响了我国推动人工草地生态环境改良及天然草地治理沙化的进度。此外，羊草具有非常强的耐盐碱能力，如果能够实现羊草遗传转化，将会极大地促进羊草对盐碱的耐受性分子机制的研究和相关功能基因的挖掘，以更快的速度培育更多优良的羊草新品种，并且可以获取对多种耐盐碱的工程植物。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)里Ti质粒的T
‑
DNA为媒介，将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。
[0004]鉴于农杆菌侵染转化羊草的重要性，建立羊草高效组培快繁体系是首要条件。羊草组织培养可以选择成熟胚和幼穗为外植体，但不同的外植体在愈伤组织的诱导、分化、再生方面有很大差异。同时基因型是影响离体培养的主要因素之一。培养基及激素也是影响羊草组培的重要因素之一。农杆菌介导转化法是目前主要采用的遗传转化方法，农杆菌是一种革兰氏阴性菌，当植物收到伤害时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，这些物质会吸引农杆菌转移到这些细胞表面，同时农杆菌所携带的T
‑
DNA就会转移到受伤的植物体中，并且最终整合到手体植物的DNA中，然后通过组培快繁再生出植株。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于提供一种通过农杆菌侵染愈伤组织，建立羊草的遗传转化体系的方法。利用本专利技术所述方法能够高效快捷的转化羊草愈伤组织，并且能得到羊草再生植株。
[0006]本专利技术采用下述技术方案予以实现：
[0007]一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法，具体包括以下步骤：
[0008]1)获得羊草组培无菌愈伤组织：以羊草的种子为外植体，在诱导培养基上进行愈
伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗；
[0009]所述的诱导培养基：MS基础培养基，5mg
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L
‑
1 2,4
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D，30g
·
L
‑
1 蔗糖，7.8g
·
L
‑
1琼脂，pH5.8；
[0010]所述的继代培养基为：MS基础培养基，2mg
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L
‑
1 2,4
‑
D，30 g
·
L
‑
1蔗糖，7.8g
·
L
‑
1琼脂；
[0011]将愈伤组织继代到分化培养基上；所述的分化培养基：MS基础培养基，30g
·
L
‑1蔗糖，7.8g
·
L
‑1琼脂，1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
D，1mg
·
L
‑1ZT，潮霉素筛选浓度为2mg
·
L
‑1；
[0012]2)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，冰上融化后，加入3uL的潮霉素(HYG)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950 μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μL YEP培养基回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50mg
·
L
‑1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；
[0013]3)活化根癌农杆菌：将步骤2)的阳性根癌农杆在培养基中培养至OD
600
值等于0.3，作为转化羊草愈伤组织的侵染液；
[0014]4)侵染羊草愈伤组织并共培养：选择步骤1)分化培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到步骤3)的根癌农杆菌侵染液中，抽真空10min，超声5min，抽真空10min；倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥；然后将侵染后的愈伤组织在滤纸上共培养3天；
[0015]5)植物转化材料的筛选培养：经步骤4)侵染的植物组织材料与根癌农杆菌共培养3天之后，取出愈伤组织在无菌条件下转到筛选培养基上，暗培养筛选1.5
‑
2月，每2周继代一次以保持抗生素筛选压力的稳定；
[0016]进一步，筛选培养基上：MS基础培养基，30g
·
L
‑1蔗糖，7.8g
·
L
‑1琼脂，2mg
·
L
‑
1 2,4
‑
D，300mg L
‑1特美汀，30mg
·
L
‑1潮霉素。
[0017]6)分化筛选培养基及培养条件：将步骤5)暗培养筛选后的愈伤组织转移到分化筛选培养基上，所述分化筛选培养基：MS基础培养基，30g
·
L
‑1蔗糖，7.8g
·
L
‑1琼脂，1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
D，1mg
·
L
‑1ZT，300 mg L
‑1特美汀，2mg
·
L
‑1潮霉素，光照强度2000lx，15
‑
25天继代一次；经过4
‑
6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；光周期为8小时光照，16小时黑暗；2
‑
3月后，阳性愈伤组织进行分化；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法，其特征在于所述方法具体包括以下步骤：1)获得羊草组培无菌愈伤组织：以羊草的种子为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗，然后将愈伤组织继代到分化培养基上；所述的诱导培养基：MS基础培养基，5mg
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L
‑
1 2,4
‑
D，30g
·
L
‑
1蔗糖，7.8g
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L
‑
1琼脂，pH5.8；所述的继代培养基为：MS基础培养基，2mg
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L
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1 2,4
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D，30g
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L
‑
1蔗糖，7.8g
·
L
‑
1琼脂；所述的分化培养基：MS基础培养基，30g
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L
‑1蔗糖，7.8g
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L
‑1琼脂，1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
D，1mg
·
L
‑1ZT，潮霉素筛选浓度为2mg
·
L
‑1；2)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，冰上融化后，加入3uL的潮霉素质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μL YEP培养基回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50mg
·
L
‑1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；3)活化根癌农杆菌：将步骤2)的阳性根癌农杆在培养基中培养至OD
600
值等于0.3，作为转化羊草愈伤组织的侵染液；4)侵染羊草愈伤组织并共培养：选择步骤1)分化培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到步骤3)的根癌农杆菌侵染液中，抽真空10min...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，赵海霞，曹英萍，申忠宝，尤佳，王建丽，曹晓风，宋显伟，张率斌，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院草业研究所中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：