一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒，属于病毒检测技术领域。鉴于现场检测过程中缺少快速检测GETV特异性抗体的方法，本发明专利技术建立一种盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是将合成的E2基因克隆至原核表达载体pCold I中构建重组质粒pCold I

【技术实现步骤摘要】
一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒，属于病毒检测


技术介绍

[0002]盖他病毒(Getahvirus，GETV)最早于1955年从马来西亚的蚊子体内所分离得到，被命名为GetahvirusMM2021。至今已发现该病毒广泛分布于亚洲、东欧和澳大利亚等地区；从热带气候到北部冻原，从北半球到南半球，GETV分布呈生态系统多样性。
[0003]GETV主要是靠媒介传播，其中蚊子是主要媒介。血清学的证据显示，GETV抗体普遍存于脊椎动物的血液中。GETV的致病机理十分复杂，它的主要宿主是脊椎动物中的马和猪。 1980，首次证明了赛马的发病与盖他病毒有直接关系。赛马呈现高烧不退，直肠温度持续 38.5℃
‑
40℃，全身长有红斑，后腿红肿行动不便。仔猪感染GETV后，可引起仔猪厌食，皮肤红变，震颤，甚至死亡，妊娠母猪感染GETV后会引起母猪繁殖障碍，出现流产，产生死胎、木乃伊胎或产生畸形胎、弱胎等。
>[0004]由于G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以E2基因作为目的基因，采用人工直接合成抗原结构域进行原核表达制备得到重组E2抗原，以E2蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。2.根据权利要求1所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组E2抗原的制备方法具体包括如下步骤：(1)将合成基因pUC57
‑
E2质粒和表达载体pColdⅠ(+)空载体进行EcoR
ꢀⅠ
和XbaⅠ双酶切，获得具有粘性末端的E2基因和pCold
ꢀⅠ
，依次将各组分加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴5h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段；E2蛋白的编码氨基酸序列如SEQ.No:1所示，E2蛋白的氨基酸序列如SEQ.No:2所示；(2)鉴定正确的胶回收产物目的基因GETV
‑
E2和表达载体pCold
ꢀⅠ
用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，后将产物转化感受态细胞BL21，菌液均匀涂于含有氨苄霉素的LB琼脂平板进行培养；(3)阳性克隆质粒的酶切鉴定：挑取单菌落，使用含氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，37℃200rpm震荡10
‑
12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用EcoR I和Xba
ꢀⅠ
限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，使用EcoR I单酶切克隆菌做阴性对照，双酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，将所含阳性条带的菌液进行测序；(4)IPTG诱导E2蛋白的表达：取测序正确的阳性菌液逐级接种到含氨苄霉素的LB肉汤培养基，37℃200rpm震荡过夜，至OD＝0.4
‑
0.6，加入5μl 0.1mmol/L IPTG于18℃低温诱导过夜,即可诱导E2蛋白的表达。3.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中pUC57
‑
E2质粒酶切反应体系组成为pUC57
‑
E2 45μl，EcoRⅠ2μl，Xba I 2μl，10
×
M Buffer 10μl，ddH2O 41μl；pColdⅠ(+)酶切反应体系组成为pColdⅠ(+)35μl，EcoR<...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏建超，马志永，孙卿，张妍，邱亚峰，李蓓蓓，李宗杰，刘珂，邵东华，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：