应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法，包括：步骤1、将氯金酸溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸三纳溶液，冷却至室温后得到GNPS；步骤2、利用投射电子显微镜对金纳米粒子进行表征；步骤3、将所述GNPS溶液加入巯基修饰的适配子，最终所得的金纳米适配子浓度为9.2nM；步骤4、取金纳米适配子与无菌去离子水，分别与适量的鲤春血症病毒液混匀，加入不同浓度氯化钠溶液，观察颜色变化，同时设立阴性对照。本发明专利技术的有益效果是：SVCV适配子与金纳米粒子连接，构建适配子金探针检测方法，无需大型仪器和特殊试剂，在室温下仅凭肉眼就可以完成SVCV的快速检测。成SVCV的快速检测。成SVCV的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法。

技术介绍

[0002]鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp，简称SVC)是由鲤春病毒(SVCV)引起的鲤鱼最主要传染病之一，SVC病毒感染是致死性的，它破坏鱼体的水盐平衡，在临床上表现为水肿和出血症状，当病鱼出现显性感染时，其肾、脾、鳃、脑中含有大量病毒。专利CN202110218870.6公开了一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，采用的是RPA技术与胶体金试纸条配合的方法，这个方法需要对鲤春病毒进行核酸提取，再进行RPA恒温扩增后，再用胶体金试纸条检测，检测时需要提取核酸——RPA反应——试纸条检测三个环节。
[0003]当前，对鲤春病毒检测主要依靠核酸检测、斑点杂交和PCR等分子生物学技术，但样品前处理繁琐费时，仪器昂贵，且需要专门的分析技术人员，在一个反应体系中只能对极少量的病原菌进行鉴定，这就大大降低了检测效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是：克服现有技术中存在的不足，提供一种应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]一种应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1、将氯金酸溶液加热至沸腾后，快速向急剧搅拌中的该溶液加入柠檬酸三纳溶液，待混合溶液由淡黄色转变为稳定的深红色，保持沸腾数分钟，然后关闭热源，冷却至室温后既得金纳米粒子溶液GNPS；
[0008]步骤2、利用投射电子显微镜对金纳米粒子进行表征，采用荧光分光广度计对所述GNPs溶液进行400～700nm波长范围的扫面，表征样品对应的特征吸收峰；
[0009]步骤3、将所述GNPS溶液加入巯基修饰的适配子，40～60℃反应10～20h，再加入10mM PBS及氯化钠0.1M，继续50℃反应30～50h后离心20～30min，向反应体系加入10mM PBS 1mL、0.1M氯化钠及0.01％Tween
‑
20，再次离心20～30min，弃上清加入0.25mL的相同溶液，最终所得金纳米适配子浓度为9.2nM；
[0010]步骤4、取金纳米适配子与无菌去离子水，分别与适量的鲤春血症病毒液混匀，混匀后于37℃孵育20～40min，加入不同浓度氯化钠溶液，观察颜色变化，同时设立阴性对照。
[0011]进一步地，所述步骤1中，所述氯金酸溶液浓度为1mM，柠檬酸三钠溶液浓度为38.8mM，氯金酸溶液：柠檬酸三钠溶液体积比为10：1。
[0012]进一步地，所述步骤4中金纳米适配子取25μL，无菌去离子水取475μL。
[0013]进一步地,所述步骤3中SVCV适配子按如下步骤获得：
[0014]S1、应用SELEX技术对鲤春血症病毒进行筛选；
[0015]S2、通过磁珠捕获法制备下一轮筛选所需要的ssDNA文库，除首轮筛选外，ssDNA文库的量在170～250pmol；
[0016]S3、在第5轮和第7轮分别用其他病毒作为反筛病毒进行消减筛选；
[0017]S4、用SELEX技术依次对鲤春血症病毒进行9轮筛选后，结束筛选；
[0018]S5、对筛选产物进行克隆。
[0019]进一步地，所述SVCV适配子为37个随机碱基，总长度保持一致，为80个碱基。
[0020]进一步地，所述SVCV适配子序列为：
[0021][0022]进一步地，所述SVCV适配子二级结构以茎环结构为主，所述茎环结构包括凸环和圆环，所述茎环结构中的茎由3个以上的G≡C配对组成。
[0023]本专利技术的有益效果是：以适配子技术为核心，开发鲤春病毒(SVCV)快速检测的核酸适配子探针，将SVCV适配子与金纳米粒子连接，构建适配子金探针检测方法，从而实现无需大型仪器和特殊试剂，在室温下仅凭肉眼就可以完成鲤春病毒的快速检测。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对本专利技术实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1是本专利技术实施例的金纳米适配子电镜图；
[0026]图2本专利技术实施例中12种不同方案金纳米适配子的紫外吸收光谱图；
[0027]图3是本专利技术实施例中适配子S01(dG＝
‑
6.7)二级结构图；
[0028]图4是本专利技术实施例中适配子S02(dG＝
‑
8.3)二级结构图；
[0029]图5是本专利技术实施例中适配子S03(dG＝
‑
9.7)二级结构图；
[0030]图6是本专利技术实施例中适配子S04(dG＝
‑
7.0)二级结构图；
[0031]图7是本专利技术实施例ssDNA富集库与SVCV结合率的测定结果示意图；
[0032]图8是本专利技术实施例金纳米粒子溶液加盐后的聚集现象示意图；
[0033]图9是本专利技术实施例金纳米适配子溶液加盐后的稳定性示意图；
[0034]图10是本专利技术实施例金纳米适配子特异性试验结果示意图；
[0035]图11是本专利技术实施例金纳米适配子敏感性试验结果示意图。
具体实施方式
[0036]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0037]适配子检测是近年来发展起来的新技术，将一个适配子末端交联到固相载体上作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶物质，另一个适配子的5
′
端标有相应的指示剂，如胶体金等标记转化为检测分子，当检测分子与相应的待测标本结合后就会产生肉眼可见的颜色
反应，以达到快速、简便的检测目的。
[0038]金纳米粒子(Gold nanoparticles,GNPs)是指金微小颗粒，其直径为1
‑
100nm，一般分散在水中的水溶胶，故又称胶体金。GNPs的颜色随其直径大小而呈现红色至紫色。由于GNPs具有良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应以及特殊的生物亲和效应，使它在生物、化学、免疫学等领域具有广泛的应用前景，而GNPs在生物检测体系中的应用研究是近年来的一个热点课题。
[0039]GNPs表面既可与氨基发生共价键的静电吸附，还可以与巯基通过共价结合。将单链核酸物质巯基修饰后，GNPs与其能通过共价结合形成稳定的复合物，该复合物因为有了单链核酸的相互排斥作用而较稳定，能在高盐溶液中稳定存在不发生团聚。利用核酸的互补配对破坏这种稳定的因素，GNPs将会发生聚集而导致颜色的变化。
[0040]本专利技术采用氯金酸柠檬酸三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、将氯金酸溶液加热至沸腾后，快速向急剧搅拌中的该溶液加入柠檬酸三纳溶液，待混合溶液由淡黄色转变为稳定的深红色，保持沸腾数分钟，然后关闭热源，冷却至室温后既得金纳米粒子溶液GNPS；步骤2、利用投射电子显微镜对金纳米粒子进行表征，采用荧光分光广度计对所述GNPs溶液进行400～700nm波长范围的扫面，表征样品对应的特征吸收峰；步骤3、将所述GNPS溶液加入巯基修饰的SVCV适配子，40～60℃反应10～20h，再加入10mM PBS及氯化钠0.1M，继续50℃反应30～50h后离心20～30min，向反应体系加入10mM PBS 1mL、0.1M氯化钠及0.01％Tween
‑
20，再次离心20～30min，弃上清加入0.25mL的相同溶液，最终所得金纳米适配子溶液的浓度为9.2nM；步骤4、取金纳米适配子溶液与无菌去离子水，分别与适量的鲤春血症病毒液混匀，混匀后于37℃孵育20～40min，加入不同浓度氯化钠溶液，观察颜色变化，同时设立阴性对照。2.根据权利要求1所述的应用适配子金探针技术建立鲤春血症病毒的快速检测方法，其特征在于：所述步骤1中，所述氯金酸溶液浓度为1mM，柠檬酸三钠溶液浓度为38....

【专利技术属性】
技术研发人员：尹伟力，刘晓静，阮国栋，魏玮，梁君妮，杨柏，
申请(专利权)人：尹伟力，
类型：发明
国别省市：