核酸提取试剂及滤纸干血斑样本核酸提取方法技术

本发明专利技术提供一种核酸提取试剂及滤纸干血斑样本核酸提取方法。所述试剂包括100～400mM NaCl、2.5～20mM Tris

Nucleic acid extraction reagent and filter paper nucleic acid extraction method of dry blood spot sample

【技术实现步骤摘要】
核酸提取试剂及滤纸干血斑样本核酸提取方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体地说，涉及一种核酸提取试剂及滤纸干血斑样本核酸提取方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着生物、医学和法医学等各相关领域的发展，基因检测技术得到越来约为广泛的应用，而血液样本则是基因检测中最为常见的样本类型之一。血液样本的采集需要专业医护人员进行静脉穿刺，采集好的血液需要通过冷链运输至实验室待检，用于靶核酸检测的全血样本的储存一般需要置于低温冰箱中冷冻保存，以最大程度上避免血液靶核酸的降解。
[0003]在新生儿期对严重危害新生儿健康的先天性、遗传性疾病施行的专项检查，以达到早诊断、早治疗的目的，对防止残疾、降低出生缺陷、提高出生人口素质有着重大意义。但对新生儿进行遗传病检测一个重要的局限就是可获得的血液量较少，很难采用常规的外周血采集方法获得待检样本，足跟血和指尖血是新生儿血液样本的重要来源。
[0004]滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体，使用少量的全血滴在滤纸片上制成滤纸干血斑(Dried blood spots，DBS)，使得样本有很好的生物稳定性和安全性。相比于常规血样需冷链运输，干血斑样本仅需常温运输即可，同时，常规血样到达实验室在样本分析前需要储存在超低温冰箱且占用较大的空间，而干血斑样本的储存条件就没有那么严格，可在4℃环境甚至常温环境稳定保存，占用空间也小得多。因此，干血斑样本的运输储存具有简便且低成本的优势，而且由于制备滤纸干血斑仅需要少量的血液样本，非常适合于作为新生儿遗传病筛查的标本类型。
[0005]现有的基因检测技术如测序、基因芯片等，通常需要从样本中提取出高纯度和浓度的基因组DNA作为模板。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往伴随着较高的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续检测失败的可能。因此，滤纸干血斑样本经过简单处理就能够作为模板进行后续PCR扩增检测，省去提取的过程，以期从时间、经济、结果准确性等多方面使现有基因检测技术水平得以提升。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种核酸提取试剂(核酸释放试剂)及滤纸干血斑样本核酸提取方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种核酸提取试剂(核酸释放试剂)，包括100～400mM NaCl、2.5～20mM Tris
‑
HCl(pH8.0)、10～50mM NaOH、0.1～4 mM EDTA(pH8.0)和0.01％～0.2％SDS，以水配制。
[0008]优选地，所述试剂由pH8.0的Tris
‑
HCl5 mM、pH 8.0的EDTA 1mM、SDS 0.03％、 NaCl 200mM和NaOH 35mM组成。
[0009]第二方面，本专利技术提供所述试剂在核酸提取或核酸检测中的应用，所述应用含非疾病诊断目的。
[0010]第三方面，本专利技术提供一种滤纸干血斑样本核酸提取方法，包括以下步骤：
[0011](1)用打孔器制备1
‑
3个3mm直径左右的干血斑，置于离心管中；
[0012](2)向上述离心管中加入100
‑
200μL所述核酸提取试剂，涡旋混匀5～10秒，室温静置6～10min；
[0013](3)再次涡旋混匀5～10秒，然后12000rpm离心1min，取上清即为提取的核酸样本。
[0014]所述应用含非疾病诊断目的。
[0015]优选地，所述干血斑来自新生儿血液样本。
[0016]更优选地，所述干血斑来自新生儿外周血样本，如足跟血和指尖血。
[0017]本专利技术的滤纸干血斑核酸释放试剂包含以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris
‑
HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)。
[0018]NaOH可使血红蛋白、核酸酶及其他一些蛋白变性，降低它们对PCR反应的抑制，核酸酶的变性还可减少样本中基因组DNA的降解，同时NaOH也是裂解血细胞的细胞膜的主要组分；当NaOH浓度过低时PCR抑制成分变性不彻底、细胞裂解不充分，而 NaOH浓度过高时则会使DNA聚合酶变性失活，这均会影响后续的PCR扩增过程。 SDS是阴离子表面活性剂，可加速细胞膜上脂类、蛋白等成分的溶解，NaCl可增加细胞膜的渗透性，这两种成分都有助于细胞的裂解，促进基因组DNA的释放；当SDS 或NaCl浓度过低时，细胞裂解不充分，而浓度过高时则会抑制PCR反应的进行。EDTA 作为二价阳离子螯合剂，可用于抑制细胞内源性核酸酶的活性，提高样本中基因组 DNA保存的稳定性，但当EDTA浓度过高时，则会降低PCR反应中DNA聚合酶的活性，影响反应的进行。Tris
‑
HCl为DNA的保存提供合适的pH值，可提高样本中基因组DNA 的稳定性，有利于样本的保存，同时还提供了一套很好的pH缓冲系统，用于降低NaOH 对于PCR扩增的影响；当Tris
‑
HCl浓度过高时，会消减NaOH对于血细胞的裂解效果，而浓度过低时，则无法消除NaOH对于后续PCR反应的抑制。因此优化全血样本处理液中各组分的浓度，能够提高样本预处理的效果，增加检测有效率和准确性。
[0019]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0020](一)本专利技术提供的核酸提取试剂及滤纸干血斑样本核酸提取方法，采用核酸提取试剂(核酸释放试剂)对滤纸干血斑样本进行快速核酸释放，获得的样本直接作为下游基因检测的模板，大大简化了样本处理的操作流程、缩短了样本处理时间，具有较高的时间和经济效益。
[0021](二)本专利技术样本需求量少，释放所获得的的核酸可用于PCR检测、克隆、测序、分子杂交等下游实验。
[0022](三)本专利技术的滤纸干血斑核酸快速释放的方法，无需特殊设备，试剂成本较低，操作流程简单，可推广性较强，为临床医学检验、检验检疫、疾病预防控制等提供有效手段。
[0023](四)本方法对设备要求低，节约成本，荧光PCR扩增效率高。
附图说明
[0024]图1为本专利技术较佳实施例中使用含不同Tris
‑
HCl浓度的核酸释放试剂处理的滤纸
干血斑样本的荧光PCR检测ROX通道扩增曲线图；
[0025]图2为本专利技术较佳实施例中使用含不同Tris
‑
HCl浓度的核酸释放试剂处理的滤纸干血斑样本的荧光PCR检测FAM通道扩增曲线图；
[0026]图3为本专利技术较佳实施例中使用含不同NaOH浓度的核酸释放试剂处理的滤纸干血斑样本的荧光PCR检测ROX通道扩增曲线图；
[0027]图4为本专利技术较佳实施例中使用含不同NaOH浓度的核酸释放试剂处理的滤纸干血斑样本的荧光PCR检测FAM通道扩增曲线图；
[0028]图5为本专利技术较佳实施例中使用含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸提取试剂，其特征在于，包括100～400mM NaCl、2.5～20mM Tris
‑
HCl、10～50mM NaOH、0.1～4mM EDTA和0.01％～0.2％SDS，以水配制。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，由pH8.0的Tris
‑
HCl 5mM、pH 8.0的EDTA 1mM、SDS 0.03％、NaCl 200mM和NaOH 35mM组成。3.权利要求1或2所述试剂在核酸提取或核酸检测中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。4.滤纸干血斑样本核酸提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鲁军，杨尧，纳洋，郭翠，韦淑杯，张伟，戴国华，王庆，张燕娜，李旭卉，
申请(专利权)人：苏州淦江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：