一种TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括前处理试剂、扩增反应试剂和核酸组合物；所述样本预处理试剂包括NaCl、Tris

【技术实现步骤摘要】
一种TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]先天性脊柱侧凸(Congenital Scoliosis，CS)是指由胚胎期脊柱发育异常而引起的脊柱侧凸＞10
°
的先天性畸形，临床中常以手术矫形为主要的治疗手段。先天性脊柱侧凸根据椎体发育特征可分为形成障碍型、分节不良型以及混合型三种。据文献报道，CS在整体新生儿中的发病率约为0.5
‰‑1‰
，而家族性发病率则高达1％
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5％。CS具有进展快、畸形重、并发症多等特点，如患者未得到及时诊断及治疗，随年龄增长及身体发育畸形会逐渐加重，影响患者的心肺发育，脊柱侧凸的进一步加重也会造成神经功能损害，出现双下肢感觉及运动功能异常，严重影响患者的生活质量及生存期。CS患者常合并先天性心脏病、泌尿系统及消化道畸形等多种先天发育障碍，为手术治疗带来了很大困难，且严重畸形的患者可能需要多次矫形手术，给患者及家庭带来了沉重的心理压力和经济负担。
[0003]先天性脊柱侧凸，作为一种进行性疾病，其进展性与患者年龄、畸形类型与侧凸发生位置等因素有关，该病尚未影响到患者生活质量时，不易被发现诊断。大多数先天性脊椎畸形都是在进行常规检查时偶然发现的。虽然脊椎畸形情况在胎儿发育到第20
‑
28周时即可被查知，但实际上，在新生儿出生一年内，仅有约四分之一的畸形能被有效诊出。
[0004]先天性脊柱侧凸在新生儿期一般没有明显临床表现，难以通过影像学检查进行大规模的新生儿筛查，不能在新生儿及出现明显临床症状前进行诊断，影响临床干预和预后的效果。但对于遗传性的先天性脊柱侧凸来说，相关遗传物质的变异情况可以作为疾病的重要提示指标，辅助CS的早期诊断，使得患者可以及早的得到治疗，最大程度的降低疾病对于患者的影响。有研究发现，在一类CS患者中存在包含TBX6基因的16p11.2区域的缺失(deletion)突变，进一步大规模验证发现TBX6的缺失突变只有同时合并TBX6常见亚效等位基因(由三个单核苷酸多态性位点定义：rs2289292
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rs3809627)时，才会出现CS表型。该研究首次揭示了TBX6罕见无效突变联合常见亚效等位基因共同致病的全新遗传模式。随后这一发现在多中心、多人种队列研究中得到验证，可以解释世界范围内约10％的散发CS患者病因。随着CS重要致病基因TBX6的揭示，我国学者进而提出了CS的首个分子分型
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即TBX6相关CS(TBX6
‑
Associated Congenital Scoliosis，TACS)的概念，发现TACS患者的脊柱畸形均为椎体形成障碍，表现为半椎体或蝴蝶椎，且集中于脊柱下段受累。该致病模式在全世界6个中心、4个人种中得到验证，阐明了TBX6基因导致CS的全新复合遗传机理
‑
罕见基因拷贝数变异(CNV)联合常见单核苷酸多态性(SNP)共同致病。但目前尚没有适合于使用新生儿干血斑样本进行TBX6相关CS基因检测产品。
[0005]传统的SNP分型检测方法主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、Taqman荧光定量、变性高效液相色谱(DHPLC)技术、等位基因特异性PCR、SNaPshot测序技术、高通量测序技术、基因芯片以及DNA直接测序等；检测CNV的方法包括Taqman荧光定量、aCGH基因芯
片、MLPA等。这些技术方法均具有各自的优缺点，适用于不同的应用场景。近年来，荧光探针熔解曲线技术因具有操作流程便捷、可以进行多重分析、检测成本相对较低、仪器设备要求简单等优势，正逐步成为基因检测领域最重要的技术方法之一。
[0006]已有文献报道中使用熔解曲线方法检测CNV拷贝数的技术，均是针对靶区域和内参区域设计不同的探针和引物，扩增两个区域后进行熔解曲线分析，并通过两个区域的熔解峰强度比值检测靶区域的拷贝数变异情况，由于靶区域和内参区是不同的基因序列，基因扩增效率会有差异，为了消减扩增效率不同的影响，研究者多采用很低的dNTP浓度进行限制扩增，但这种方法却会造成扩增的产物量显著降低，影响检测灵敏度。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一在于针对TBX6相关先天性脊柱侧凸，需要同时检TBX6基因三个SNP(rs2289292
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rs3809624
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rs3809627)分型和16p11.2拷贝数变异，通过荧光探针熔解曲线技术，一个扩增反应同时进行SNP分型和CNV分析，提供一种可以检测微量样本、快速处理、简便快捷、灵敏度高、可靠性强和/或成本较低的基于多色相邻探针熔解曲线技术的一种TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒。
[0008]本专利技术提供了一种用于TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测的核酸组合物，包括引物624F、624R、627F、627R、292F、292R、16p11.2F和16p11.2R，探针624P、624Q、627P、627Q、292P、292Q、16p11.2P和16p11.2Q；
[0009]所述624F为序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA，
[0010]所述624R为序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA，
[0011]所述627F为序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA，
[0012]所述627R为序列如SEQ ID No.4所示的单链DNA，
[0013]所述292F为序列如SEQ ID No.5所示的单链DNA，
[0014]所述292R为序列如SEQ ID No.6所示的单链DNA，
[0015]所述16p11.2F为序列如SEQ ID No.7所示的单链DNA，
[0016]所述16p11.2R为序列如SEQ ID No.8所示的单链DNA，
[0017]所述624P为序列如SEQ ID No.9所示的单链DNA，
[0018]所述624Q为序列如SEQ ID No.10所示的单链DNA，
[0019]所述627P为序列如SEQ ID No.11所示的单链DNA，
[0020]所述627Q为序列如SEQ ID No.12所示的单链DNA，
[0021]所述292P为序列如SEQ ID No.13所示的单链DNA，
[0022]所述292Q为序列如SEQ ID No.14所示的单链DNA，
[0023]所述16p11.2P为序列如SEQ ID No.15所示的单链DNA，
[0024]所述16p11.2Q为序列如SEQ ID No.16所示的单链DNA，
[0025]所述探针624P、627P、292P、16p11.2P一端均标记荧光基团，所述探针624Q、627Q、292Q、16p11.2Q一端本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测的核酸组合物，其特征在于：包括引物624F、624R、627F、627R、292F、292R、16p11.2F和16p11.2R，探针624P、624Q、627P、627Q、292P、292Q、16p11.2P和16p11.2Q；所述624F为序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述624R为序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA，所述627F为序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述627R为序列如SEQ ID No.4所示的单链DNA，所述292F为序列如SEQ ID No.5所示的单链DNA，所述292R为序列如SEQ ID No.6所示的单链DNA，所述16p11.2F为序列如SEQ ID No.7所示的单链DNA，所述16p11.2R为序列如SEQ ID No.8所示的单链DNA，所述624P为序列如SEQ ID No.9所示的单链DNA，所述624Q为序列如SEQ ID No.10所示的单链DNA，所述627P为序列如SEQ ID No.11所示的单链DNA，所述627Q为序列如SEQ ID No.12所示的单链DNA，所述292P为序列如SEQ ID No.13所示的单链DNA，所述292Q为序列如SEQ ID No.14所示的单链DNA，所述16p11.2P为序列如SEQ ID No.15所示的单链DNA，所述16p11.2Q为序列如SEQ ID No.16所示的单链DNA，所述探针624P、627P、292P、16p11.2P一端均标记荧光基团，所述探针624Q、627Q、292Q、16p11.2Q一端均标记淬灭基团，当所述探针具有自由3
’‑
OH时，使用阻断基团修饰。2.TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的核酸组合物。3.根据权利要求2所述的TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒，还包括样本预处理试剂和/或2
×
扩增反应试剂；所述样本预处理试剂包括NaCl、Tris
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HCl、EDTA、SDS和NaOH；所述2
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扩增反应试剂包括热启动Taq酶、UNG酶、dNTP、dUTP和PCR缓冲液
‘
。4.根据权利要求3所述的TBX6相关先天性脊柱侧凸基因检测试剂盒，其特征在于：所述样本预处理试剂包含100～200mM的NaCl、1～10mM的Tris
‑
HCl、10～50mM的NaOH、0.1～3mM的EDTA和0.01％～0.05％的SDS；所述2
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨尧，张鲁军，纳洋，郭翠，韦淑杯，张伟，戴国华，王庆，张燕娜，李旭卉，
申请(专利权)人：苏州淦江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：