检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒，可同时检测MMACHC基因的14个突变位点，包括c.1A>G、c.81+1G>A、c.217C>T、c.315C>G、c.365A>T、c.394C>T、c.445

【技术实现步骤摘要】
检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia，MMA)是有机酸代谢异常中最常见的疾病，是多种原因所致体内甲基丙二酸蓄积的总称，属于常染色体隐性遗传，分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症两种类型。国内MMA主要以甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症为主，包括cb1C、cb1D及cb1F三种亚型，其中约有90％以上为cb1C型，致病基因为MMACHC，存在热点突变位点。
[0003]甲基丙二酸血症发病年龄各异，临床表现常无特异性，常常被误诊为一般围生期脑损害、败血症、急慢性脑病或脑变性病，常见喂养困难、呕吐、呼吸急促、惊厥、肌张力异常、嗜睡、智力、运动落后或倒退。目前临床主要依靠串联质谱和气相色谱
‑
质谱检测代谢标记物进行新生儿筛查和临床诊断，质谱检测容易收到干扰，假阳性率高，发现异常进行召回复查耽误治疗时间，基因突变检测是确诊和基因分型的可靠措施，特别是通过新生儿干血斑进行快速MMACHC热点筛查，避免进行复查采样，提高患者确诊时间和效率。
[0004]目前对于MMCHC基因进行检测方法主要有Sanger测序、高通量测序技术、基因芯片、飞行时间质谱技术，这些方法由于检测步骤繁琐、仪器昂贵、检测通量限制等原因，临床应用推广受到极大限制，特别是现有方法需要较多抗凝血血液样本进行纯化DNA后进行基因检测，在新生儿筛查中心难以从收集的有限的干血斑样本进行快速基因检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术中存在的需要较多抗凝血血液样本、前处理和检测操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供可以检测微量血液样本、快速处理、简便快捷、灵敏度高、可靠性强且成本较低的基于多色探针熔解曲线而设计的用于检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒。
[0006]本专利技术构思如下：利用相邻淬灭双探针进行熔解曲线分析，相邻双探针检测系统由两条探针配合使用，一条突变检测探针标记荧光基团，配套的锚定探针标记淬灭基团，突变检测探针和锚定探针与靶标DNA结合位置相邻。在通过PCR扩增产生靶标产物DNA，熔解曲线过程中，两条探针退火杂交在目标DNA序列上，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光基团的荧光被淬灭，荧光信号低，随着温度升高，杂交双链慢慢解链，荧光标记的突变检测探针与锚定探针分离，荧光基团与淬灭基团距离变大，淬灭效果逐渐减弱，荧光信号变强，荧光信号变化速率最快的温度就是探针检测的熔点(Tm)值。突变检测探针覆盖待测的突变位点，因为突变位点的存在，突变检测探针与靶标中的突变型位点不能完全结合，造成双链结构稳定性降低，因此熔解曲线分析中Tm下降，从而实现检测遗传基因突变位点的功能。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种检测MMACHC基因突变位点的引
物组，所述引物组包括检测c.1A>G和c.81+1G>A位点的引物对I，检测c.217C>T位点的引物对II，检测c.315C>G、c.365A>T和c.394C>T位点的引物对III，检测c.445_446delTG和c.481C>T、c.482G>A位点的引物对IV，检测c.565C>A、c.567dupT、c.609G>A、c.626_627delTG和c.658_660delAAG位点的引物对V；
[0008]引物对I包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；
[0009]引物对II包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；
[0010]引物对III包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物；
[0011]引物对IV包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物和如SEQ ID NO:8所示的下游引物；
[0012]引物对V包括如SEQ ID NO:9所示的上游引物和如SEQ ID NO:10所示的下游引物。
[0013]第二方面，本专利技术提供与所述引物组配套使用的探针，包括突变检测探针和锚定探针；其中，突变检测探针5
’
端标记荧光基团，且3
’
端进行C3 Spacer修饰，同时锚定探针3
’
端标记荧光淬灭基团；或者，突变检测探针3
’
端标记荧光基团，同时锚定探针5
’
端标记荧光淬灭基团，且3
’
进行C3 Spacer修饰。
[0014]c.1A>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和12所示；
[0015]c.81+1G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和14所示；
[0016]c.217C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和16所示；
[0017]c.315C>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和18所示；
[0018]c.365A>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和18所示；
[0019]c.394C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20和21所示；
[0020]c.481C>T、c.445_446delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22和23所示；
[0021]c.482G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24和23所示；
[0022]c.565C>A和c.567dupT位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25和26所示；
[0023]c.609G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和26所示；
[0024]c.626_627delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和29所示；
[0025]c.658_660delAAG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:30和31所示。
[0026]所述荧光基团选自FAM、HEX、CY5、ROX等中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测MMACHC基因突变位点的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测c.1A>G和c.81+1G>A位点的引物对I，检测c.217C>T位点的引物对II，检测c.315C>G、c.365A>T和c.394C>T位点的引物对III，检测c.445_446delTG和c.481C>T、c.482G>A位点的引物对IV，检测c.565C>A、c.567dupT、c.609G>A、c.626_627delTG和c.658_660delAAG位点的引物对V；引物对I包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；引物对II包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；引物对III包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物；引物对IV包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物和如SEQ ID NO:8所示的下游引物；引物对V包括如SEQ ID NO:9所示的上游引物和如SEQ ID NO:10所示的下游引物。2.与权利要求1所述引物组配套使用的探针，其特征在于，包括突变检测探针和锚定探针；其中，突变检测探针5
’
端标记荧光基团，且3
’
端进行C3 Spacer修饰，同时锚定探针3
’
端标记荧光淬灭基团；或者，突变检测探针3
’
端标记荧光基团，同时锚定探针5
’
端标记荧光淬灭基团，且3
’
进行C3 Spacer修饰；c.1A>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和12所示；c.81+1G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和14所示；c.217C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和16所示；c.315C>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和18所示；c.365A>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和18所示；c.394C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20和21所示；c.445_446delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22和23所示；c.481C>T、c.482G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24和23所示；c.565C>A和c.567dupT位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25和26所示；c.609G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和26所示；c.626_627delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和29所示；c.658_660delAAG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨尧，张鲁军，郭翠，韦淑杯，张伟，戴国华，王庆，张燕娜，李旭卉，纳洋，
申请(专利权)人：苏州淦江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：