预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒，DNA羟甲基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险程度。本发明专利技术提供的NPPA基因DNA羟甲基化标志物可用于预测缺血性脑卒中发病风险，也可以作为预防和控制缺血性脑卒中的干预靶点，不仅有助于阐释心房利钠肽作用于缺血性脑卒中的分子机制，也将为NPPA基因羟甲基化作为预防和控制缺血性脑卒中的药物靶点提供重要的流行病学证据。供重要的流行病学证据。供重要的流行病学证据。

DNA hydroxymethylation markers and kits for predicting the risk of ischemic stroke

【技术实现步骤摘要】
预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来虽然我国在心脑血管疾病的预防和治疗方面已取得一定的成绩，但脑卒中发病率、患病率、复发率和死亡率仍然居高不下，是我国居民死亡和残疾的首要原因，且随着社会老龄化和城市化进程加速，居民不健康生活方式流行，心脑血管疾病危险因素普遍暴露，我国脑卒中疾病未来有爆发式增长的态势。脑卒中主要可以分为缺血性脑卒中和出血性卒中两类，我国脑卒中主要以缺血性脑卒中为主，约占脑卒中总数的70％～80％。据全球疾病负担研究(GBD)数据显示，我国缺血性脑卒中的患病率由2010年的1100/10 万上升至2019年的1256/10万，出血性卒中的患病率由2010年的232/10 万下降至215/10万，脑卒中患病率总体呈上升趋势。另外，《中国卒中报告2019》显示我国每5位死者中至少有1人死于脑卒中，带病生存的脑卒中患者在我国已多达1300万。因此，如何有效地预防和控制脑卒中主要的类型(缺血性脑卒中)，寻找并发现更多缺血性脑卒中的潜在危险因素和干预靶点迫在眉睫。
[0003]利钠肽轴是机体应对外界环境刺激的重要的心脏内分泌调节系统，在维持机体水钠平衡、血压稳定和能量代谢平衡方面发挥着重要作用。利钠肽轴主要由心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)、C型钠尿肽(CNP)以及他们的受体构成。当血容量增加时，心肌细胞就会分泌并释放大量的无生物活性的心房钠尿肽前体(pro
‑
ANP)和脑钠尿肽前体(pro
‑
BNP)，pro
‑
ANP、pro
‑
NNP进一步活化为有活性的ANP和BNP，并与其受体结合激活利钠肽轴，进而促进水钠代谢、降低血容量、扩张血管、促进能量代谢，从而维持心血管稳态。作为利钠肽轴的重要组成之一，ANP可能在缺血性脑卒中的发生发展过程中扮演重要角色，已有大量流行病学证据支持这一假设，例如， ANP的编码基因NPPA的基因多态性与高血压、脑卒中、心肌梗死和冠心病的人群易感性显著相关；人工合成的ANP(重组卡培立肽、缬沙坦)已经被用来治疗急性心衰，但会引起低血压和血管性水肿等不良结局。可见，合成ANP作为药物可能存在较大隐患，更好的理解ANP参与缺血性脑卒中的作用机理将有助于针对ANP的药物研发，促进ANP的相关研究结果向临床转化。但是，尚未见关于NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性脑卒中的研究报道，也没有报道一种合适的羟甲基化标志物可作为缺血性脑卒中的干预靶点。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术通过对NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性脑卒中相关性的研究，提供了一种与缺血性脑卒中相关的DNA羟甲基化标志物，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险，有助于阐释心房利钠肽作用于缺血性脑卒中的分子机制，且羟甲基化水平每增加2倍，缺血性脑卒中的发病风险升高39％，检测灵敏度高。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物，该DNA羟甲基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险程度。
[0006]进一步地，DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的羟甲基化水平高于2.5％指示缺血性脑卒中发病风险较高。
[0007]进一步地，DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的羟甲基化水平每增加2倍，缺血性脑卒中的发病风险升高39％。
[0008]进一步地，扩增上述DNA羟甲基化标志物的上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。
[0009]进一步地，检测上述DNA羟甲基化标志物的羟甲基化水平包括以下步骤：
[0010](1)提取DNA样本，用T4β
‑
葡糖基转移酶和APOBEC3A酶处理DNA样本；
[0011](2)用合适的引物对(如上述SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)扩增步骤(1)处理后的DNA样本，得到扩增产物；
[0012](3)对步骤(2)的扩增产物进行转录和酶切，得到转录和酶切产物；
[0013](4)对步骤(3)的转录和酶切产物进行检测，获取序列中Chr1:11908348位点的羟甲基化程度。
[0014]进一步地，DNA样本为血液样本。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供上述DNA羟甲基化标志物在制备预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒中的应用。
[0016]进一步地，试剂盒中还包括扩增NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的引物。
[0017]进一步地，上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供扩增上述DNA羟甲基化标志物的引物在制备预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒中的应用，上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，具体地，
[0019]F：TTTTGTTTGAGGTTAGAGGTTTGTTTA
[0020]R：AAAAATCCTTAATTATCTCACCRCC，其中，R表示碱基A/G。
[0021]本专利技术的第四个目的是提供一种预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒，该试剂盒中包括：扩增NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的引物。
[0022]进一步地，试剂盒中还包括检测NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348羟甲基化水平的试剂。
[0023]本专利技术的第五个目的是提供上述DNA羟甲基化标志物在制备缺血性脑卒中治疗药物中的应用，以NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348为靶点进行设计，抑制该靶点的羟甲基化水平。
[0024]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0025]本专利技术提供的NPPA基因DNA羟甲基化标志物可用于预测缺血性脑卒中的发病风险，也可以作为预防和控制缺血性脑卒中的干预靶点，该羟甲基化标志物的检测灵敏度明显优于现有的缺血性脑卒中的检测标志物，同时具有良好的准确度和特异性。
[0026]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，
并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0027]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明。
[0028]图1为本专利技术的DNA羟甲基化标志物的示意图；
[0029]图2为检测的NPPA基因启动子区域9个CpG位点的示意图，其中2 号位点为本专利技术的羟甲基化标志物；
[0030]图3为NPPA基因DNA羟甲基化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物，其特征在于：所述DNA羟甲基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险程度。2.根据权利要求1所述的DNA羟甲基化标志物，其特征在于：所述DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的羟甲基化水平每增加2倍，缺血性脑卒中的发病风险升高39％。3.根据权利要求1所述的DNA羟甲基化标志物，其特征在于：扩增所述DNA羟甲基化标志物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的DNA羟甲基化标志物，其特征在于，检测所述DNA羟甲基化标志物的羟甲基化水平包括以下步骤：(1)提取DNA样本，用T4β
‑
葡糖基转移酶和APOBEC3A酶处理所述DNA样本；(2)扩增步骤(1)处理后的DNA样本，得到扩增产物；(3)对步骤(2)的扩增产物进行转录和酶切，得到转录和酶切产物；(4)对步骤(3)的转录和酶切产物进行检测，获取序列中Chr1:11908348位点的羟甲基化程...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭浩，姚佳玲，刘洋，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：