一种提高普那霉素产量的发酵方法技术

本发明专利技术提供了一种提高普那霉素产量的发酵方法，所述方法包括：在发酵培养过程中，向发酵培养基中补加正丙醇。本发明专利技术实现了普那霉素产量的大幅提升，降低了生产成本，有利于工业化生产。化生产。

A fermentation method for increasing the yield of panamycin

【技术实现步骤摘要】
一种提高普那霉素产量的发酵方法


[0001]本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高普那霉素产量的发酵方法。

技术介绍

[0002]普那霉素(pristinamycins)属链阳性菌素类抗生素，于1955年从始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)中分离得到，由约30％普那霉素I和70％普那霉素II组成。其中普那霉素I是由普那霉素IA、普那霉素IB、普那霉素IC组成的环六肽内酯，普那霉素II是由普那霉素IIA和普那霉素IIB组成的多不饱和内酯。普那霉素IA和普那霉素IIA是普那霉素的主要组分。
[0003]普那霉素对革兰阳性菌具有较强的杀菌活性，主要用于治疗由革兰阳性菌包括耐药菌引起的感染。然而天然的普那霉素水溶性差，不易制成肠外制剂，因此临床应用受到限制。天然的普那霉素IA和IIA经过化学修饰得到水溶性衍生物RP59500(商品名Synercid)则可以解决这一问题，它是第一个上市的链阳性菌素注射剂。
[0004]普那霉素的具体结构式如下：
[0005][0006]虽然普那霉素具有广泛的应用，且其制剂成品已经上市，但普那霉素较低的发酵产量和较高的生产成本，仍然是限制其应用的和发展的主要因素。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术中普那霉素产量低、生产成本高的问题，提供了一种提高
普那霉素产量的发酵方法，所述方法包括：
[0008]在发酵培养过程中，向发酵培养基中补加正丙醇。
[0009]优选的，所述补加的时间为发酵培养开始后的10
‑
60h，优选10
‑
50h，更优选20
‑
50h，最优选30
‑
40h。
[0010]优选的，所述补加正丙醇采用连续补加的方式，补加速率为发酵培养基初始体积的0.04
‑
0.1％/天，优选0.06
‑
0.08％/天。
[0011]优选的，所述发酵培养基包含：2
‑
10g/100mL碳源，2
‑
5g/100mL氮源，0.2
‑
1.0g/100mL无机盐。
[0012]优选的，所述发酵培养基的碳源选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精、可溶性淀粉、山梨醇、甘油之一或者上述物质的组合，优选可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖的组合。
[0013]优选的，所述发酵培养基的氮源选自黄豆饼粉、酵母粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉、花生饼粉、大豆粉、玉米浆干粉、酵母抽提物、蛋白胨之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉和酵母粉的组合。
[0014]优选的，所述发酵培养基包含：可溶性淀粉3.0
±
0.6，葡萄糖2.0
±
0.4，蔗糖0.5
±
0.1，黄豆饼粉2.0
±
0.4，酵母粉0.5
±
0.1，硫酸铵0.2
±
0.04，硫酸锰0.1
±
0.02，硫酸亚铁0.01
±
0.002，磷酸二氢钾0.05
±
0.01，碳酸钙0.3
±
0.06，单位为g/100mL，pH＝7.0
±
0.2。
[0015]优选的，所述发酵培养的时间为80
‑
160h，优选100
‑
160h。
[0016]优选的，所述发酵培养的条件为：温度27
±
1.0℃，通气量0.5
‑
1.0VVM，罐压0.045
‑
0.065MPa，溶氧30
‑
100％。
[0017]本专利技术通过流加葡萄糖溶液的方式，将葡萄糖含量控制在0.2
‑
1.0％(葡萄糖在实时发酵培养基中的含量，单位为g/mL)。葡萄糖溶液的浓度为50％(g/mL)，121.0
‑
123.0℃灭菌30min后使用，发酵过程中当培养基中葡萄糖的含量低于1.0％时开始流加。
[0018]本专利技术发酵培养使用的菌株是任意可产普那霉素的始旋链霉菌，例如可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的始旋链霉菌Streptomyces pristinaespiralis，ATCC 25486(其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC 4.1352)。
[0019]从生物合成的角度分析，普那霉素合成的起始单位是氨基酸，包括苯丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸等。但本专利技术人发现，补加氨基酸并未明显提高普那霉素的产量，因此推测阻碍普那霉素合成的主要限制因素并非起始氨基酸，而是其碳链的延伸单位。普那霉素的内酯环的形成是以乙酸为起始单位的，专利技术人推测其碳链的延伸单位可能是短链脂肪酸/短链脂肪酸钠，根据这一原理，分别尝试补加甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠、丁二酸钠等，但对提高普那霉素产量无明显影响。
[0020]通常，正丙醇对于微生物的生长代谢是具有毒害作用的，但本专利技术人意外发现，加入正丙醇(尤其是一定条件下)能够大幅提高普那霉素的产量。但对于加入与正丙醇相似的乙醇，却降低了普那霉素的产量。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：
[0022]本专利技术通过在发酵培养过程中，向发酵培养基中补加正丙醇，能够大幅提高普那霉素的产量，发酵培养基组分简单，成本低廉，在工艺控制上简便易行，降低了普那霉素的生产成本，有利于工业化生产。
具体实施方式
[0023]以下实施例对本专利技术作进一步说明。然而，本专利技术可能具体体现为许多不同的形式，例如不同培养基或者相似的菌株均有均能达到相似的效果，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例的目的是为了使所披露内容更完整。在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度；除非另有指明，各种起始原料和试剂均来自市售，均不经进一步纯化直接使用；除非另有指明，各种溶剂均为工业级溶剂，不经进一步处理直接使用。
[0024]本实施例中所测的普那霉素含量指的是普那霉素IA和普那霉素IIA两种主要成分的含量之和，检测条件如下：
[0025]色谱柱：Agilent Zorbax C
18
柱(4.6mm x250mm x 5μm)；
[0026]流动相A：磷酸缓冲液(0.03mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至2.3)；
[0027]流动相B：乙腈；
[0028]流速：1.0mL/min；
[0029]线性梯度：在0
‑
22min:B相由35％到35％，在22
‑
40min：B相由35％到80％，在40
‑
50min：B相由80％到35％，在50
‑
60min：B相由35％到35％；
[0030]柱温：30℃；
[0031]检测波长：210n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高普那霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：在发酵培养过程中，向发酵培养基中补加正丙醇。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述补加的时间为发酵培养开始后的10
‑
60h，优选10
‑
50h，更优选20
‑
50h，最优选30
‑
40h。3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述补加正丙醇采用连续补加的方式，补加速率为发酵培养基初始体积的0.04
‑
0.1％/天，优选0.06
‑
0.08％/天。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：2
‑
10g/100mL碳源，2
‑
5g/100mL氮源，0.2
‑
1.0g/100mL无机盐。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精、可溶性淀粉、山梨醇、甘油之一或者上述物质的组合，优选可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖的组合。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的氮源选自黄豆饼粉、酵母粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹渊博，万婷婷，陈晨，周淼军，李露军，沈雅文，杨俊杰，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：