一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒技术

一种涉及甘薯病毒检测技术领域的同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒，所述试剂盒包含10

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及甘薯病毒检测
，尤其是涉及一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]公知的，甘薯是利用块根进行无性繁殖的植物，在栽培过程中极易受病毒的侵染，病毒侵染后对甘薯的产量和品质有很大影响；近年我国甘薯病毒发生率呈上升趋势，目前在广东、福建、江苏、四川、北京、山东等地均检测到有多种病毒的混合侵染现象，据报道中国每年因甘薯病毒造成的损失高达40亿元，甘薯病毒已经成为影响甘薯生产的重要限制因素之一；目前已经鉴定的甘薯病毒有甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）等；而经常出现的情况就是多种甘薯病毒的复合侵染，极大的影响了甘薯产量的提高，也直接制约了整个甘薯产业的整体发展；使用茎尖脱毒快繁法繁育甘薯试管苗，能最大程度减少初期甘薯病毒病的发生，诱导再生的“脱毒苗”需要经过严格的病毒检测，确认不带病毒后，才能后续供应给薯农种植，但脱毒的试管苗可能在田间种植阶段再次染上病毒病，检测甘薯病毒病的方法就显得尤为重要；但是目前进行病毒检测一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两个以上的甘薯病毒，则需进行多次PCR，成本高且费时费力。

技术实现思路

[0003]为了克服
技术介绍
中不能同时检测两个以上的甘薯病毒的问题，本专利技术公开了一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒。
[0004]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种同时检测3种甘薯病毒的多重RT
‑
PCR检测试剂盒，包括分别盛装有10
×
反应缓冲液1.5mL、Taq酶（1U/μL）1.5mL、3种甘薯病毒的上游引物混合物SP
‑
F(10μΜ) 0.5 mL、3种甘薯病毒的下游引物混合物SP
‑
R(10μΜ) 0.5 mL和阳性标准品(15μg/mL)0.5 mL的离心管；3种甘薯病毒分别为甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒；3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为：
①
甘薯褪绿矮化病毒 SPCSV
‑
F/R，上游引物SPCSV
‑
F为5'
‑
CTTACCTCAGACCAGTTAGC
‑
3'，下游引物SPCSV
‑
R为5'
‑
CGTTATTGTAGCCTCACCAG
‑
3'；
②
甘薯羽状斑驳病毒 SPFMV F/R，上游引物SPFMV
‑
F为5'
‑
GGCAGATTATGACGCACTTC
‑
3'，下游引物SPFMV
‑
R为5'
‑
GTGTGCCTCTCCGTATCTTC
‑
3'；
③
甘薯潜隐病毒 SPLV F/R，上游引物SPLV
‑
F为5'
‑
CCAAGGCTACAAGGAGTCAG
‑
3'，
下游引物SPLV
‑
R为5'
‑
ACATTTCCATCCAAACCCGA
‑
3'；所述阳性标准品为提取感染的甘薯病株RNA，并分别进行反转录得cDNA，利用3种甘薯病毒的CP基因全长引物分别进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，得到的阳性样品的CP基因进行克隆载体的构建，并将所得3个重组载体质粒按1︰1︰1进行混合作为阳性标准品液。
[0005]优选的，所述10
×
反应缓冲液为Tris
‑
HCl 100mM、KCl 500mM和dNTPs 2.5mM。
[0006]优选的，所述试剂盒还包括阴性对照，该阴性对照为纯水或无病毒甘薯总RNA。
[0007]一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法，包括以下步骤：
①
用RNA提取试剂盒(Takara)提取待测样本总RNA，并进行反转录得cDNA；
②
PCR扩增；用权利要求1所述的3种甘薯病毒的上游引物和下游引物对待测样品cDNA进行PCR扩增，其反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环32次，最后72℃延伸5min；
③
取5μL步骤
②
的 PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的2%琼脂糖凝胶上电泳，恒压100V，20min后紫外透射反射仪上观察结果；
④
结果判定；当150bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）侵染；当280bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）侵染；当480bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯潜隐病毒（SPLV）侵染。
[0008]由于采用如上所述的技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术公开的一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒，可实现一次PCR反应同时检测3种甘薯病毒，减少操作次数，避免交叉污染，同时还减少试剂、引物、模板及耗材等的使用量，省时、省力、省成本；实验表明，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘薯组织中同时检测这3种甘薯病毒，明确甘薯带毒情况，对尽早采取有效防治措施，控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，同时为健康种苗的发展奠定重要的基础，为方便应用本专利技术，专利技术人还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。
附图说明
[0009]图1为本专利技术检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）CP基因的特异性扩增图；图2为本专利技术检测甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）CP基因的特异性扩增图；图3为本专利技术检测甘薯潜隐病毒（SPLV）CP基因的特异性扩增图；图4为本专利技术检测甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）和甘薯潜隐病毒（SPLV）CP基因的特异性扩增图。
[0010]图1中M：DNA Marker
ꢀⅠ
。 Marker；l：SPCSV。
[0011]图2中M：DNA Marker
ꢀⅠ
。 Marker；l：SPFMV。
[0012]图3中M：DNA Marker
ꢀⅠ
。 Marker；l：SPLV。
[0013]图4中M：DNA Marker
ꢀⅠ
。 Marker；l：SPCSV / SPFMV /SPLV。
具体实施方式
[0014]通过下面的实施例可以详细的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测3种甘薯病毒的多重RT
‑
PCR检测试剂盒，其特征在于：包括分别盛装有10
×
反应缓冲液1.5mL、Taq酶（1U/μL）1.5mL、3种甘薯病毒的上游引物混合物SP
‑
F(10μΜ) 0.5 mL、3种甘薯病毒的下游引物混合物SP
‑
R(10μΜ) 0.5 mL和阳性标准品(15μg/mL)0.5 mL的离心管；3种甘薯病毒分别为甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒；3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为：
①
甘薯褪绿矮化病毒 SPCSV
‑
F/R，上游引物SPCSV
‑
F为5'
‑
CTTACCTCAGACCAGTTAGC
‑
3'，下游引物SPCSV
‑
R为5'
‑
CGTTATTGTAGCCTCACCAG
‑
3'；
②
甘薯羽状斑驳病毒 SPFMV F/R，上游引物SPFMV
‑
F为5'
‑
GGCAGATTATGACGCACTTC
‑
3'，下游引物SPFMV
‑
R为5'
‑
GTGTGCCTCTCCGTATCTTC
‑
3'；
③
甘薯潜隐病毒 SPLV F/R，上游引物SPLV
‑
F为5'
‑
CCAAGGCTACAAGGAGTCAG
‑
3'，下游引物SPLV
‑
R为5'
‑
ACATTTCCATCCAAACCCGA
‑
3'；所述阳性标...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小梅，李广录，侯文邦，
申请(专利权)人：洛阳薯乡薯业科创园有限公司，
类型：发明
国别省市：