一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在单纯疱疹病毒I型和2型基因组上筛选的区分于其他物种且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP

【技术实现步骤摘要】
一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，特别涉及一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)是一类DNA病毒，能引起类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。妊娠妇女感染HSV
‑
I，病毒有可能经胎盘感染胎儿，造成流产、死胎或先天性畸形，新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染。因此HSV筛查是妊娠期妇女必检的项目之一。
[0003]已有的检测和分型方法主要基于抗原抗体反应，将HSV分为HSV
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1和HSV
‑
2两个血清型，但这种检测分型方法存在灵敏度低，分型不准确的局限。近年来，分子生物学的发展迅速，以遗传物质为基础的检测分型系统得以发展，其中包括基于RCA方法、荧光PCR和宏基因测序的方法。基于RCA和荧光PCR一次只检测HSV
‑
1和HSV
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2中的一种，或者同时检测两种，但检测的标记数目有限，通常是一种型只检测一个标记，且不能检测变异，少数几个位点的检测容易检测失败，存在检测效率低和准确性低的局限。基于测序技术的方法，比如宏基因组测序技术往往包括大量的宿主测序数据，尤其对HSV低浓度的样本进行检测时，需要超深度的测序，想要检测变异进行分型，会导致超高的难以接受的测序成本。已有的方法主要通过检测SNP标记进行亚型的区分，但SNP标记存在多态性低，分型错误率高和物种区分能力弱的局限。单纯疱疹病毒为群体性生物，群体中个体的变异导致在一个标记位点会存在多个等位基因型且存在低频的基因型，SNP标记是二态性标记，难以捕获群体生物普遍存在的多等位基因型，存在标记多态性低、检测方法准确性和灵敏度低的缺陷。
[0004]因此，开发单纯疱疹病毒的高多态性的新型分子标记及其高效、准确和灵敏的检测技术，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以一次性对单纯疱疹病毒I型和2型进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在单纯疱疹病毒1型和2型基因组上筛选的物种特异的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括以NC_001806.2为参考基因组的MNP
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1～MNP
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7的标记位点和以LS480640.1为参考基因组的MNP
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8～MNP
‑
14的标记位点。
[0008]上述技术方案中，MNP
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1～MNP
‑
14的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的
所述MNP标记的起始和终止位置是分别基于表1中NC_001806.2和LS480640.1的序列确定的。
[0009]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括14对引物，所述14对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.28所示。
[0010]上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。
[0011]在本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0013]在本专利技术的第四方面，提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒的鉴定和制备单纯疱疹病毒鉴定产品中的应用。
[0014]在本专利技术的第五方面，提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在检测单纯疱疹病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用
[0015]在本专利技术的第六方面，提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建单纯疱疹病毒数据库中的应用。
[0016]在本专利技术的第七方面，提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒分型检测中的应用。
[0017]以上所述的应用中，首先是获取待测样本的病毒总DNA；利用本专利技术的试剂盒对所述DNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于25个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；测序结果比对到所述的单纯疱疹病毒的参考序列上，获取在所述DNA中的检测序列数目和基因型数据。根据在所述DNA和所述空白对照获得的单纯疱疹病毒测序序列数量和检出MNP标记的数目，对所述DNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得在所述样本中检出的单纯疱疹病毒MNP标记数目、覆盖每个所述MNP标记的测序序列数目和所述MNP标记基因型数据。
[0018]当用于单纯疱疹病毒鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的单纯疱疹病毒的测序序列数量和检出MNP标记的数目，进行质控后判定待测样品中是否含有单纯疱疹病毒的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的单纯疱疹病毒的DNA为检测样本，评估所述试剂盒检测单纯疱疹病毒的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测单纯疱疹病毒时的质控方案和判定方法。
[0019]当用于单纯疱疹病毒遗传变异检测时，包括毒株间和毒株内部的遗传变异检测。毒株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较毒株各自在检出的所述MNP标记的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较毒株在所述MNP标记位点上的主基因型是否存在差异。若待比较毒株在至少一个MNP标记的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较毒株的14个MNP标记位点分别进行扩增，然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较毒株每个MNP标记的基
因型进行比对。如果存在主基因型(在一个MNP标记具有超过50％测序片段支持的基因型)不一致的MNP标记，则待比较毒株之间存在变异。当检测毒株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测毒株所述的MNP标记是否检出主基因型以外的次基因型。若待测毒株在至少一个MNP标记存在次基因型，则判定待测毒株内部存在遗传变异。
[0020]当用于构建单纯疱疹病毒DNA指本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在单纯疱疹病毒I型和2型基因组上筛选的区分于其他物种且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括以NC_001806.2为参考基因组的MNP
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1～MNP
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17的标记位点和以LS480640.1为参考基因组的MNP
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8～MNP
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14的标记位点。2.一种用于检测权利要求1所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括14对引物，所述14对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.28所示。3.一种用于检测权利要求1所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：高利芬，李论，周俊飞，肖华锋，陈利红，彭海，李甜甜，方治伟，万人静，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：