一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法。该设计借助化学偶联的方式，利用ssDNA将产糖酶修饰至磁珠上，从而制备功能化磁珠传感器。具体检测流程包括：(1)借助等温扩增技术对核酸检测片段进行扩增；(2)通过CRISPR/Cas12a体系对扩增片段进行识别，利用其核酸酶活性释放功能化磁珠上的产葡萄糖酶类；(3)通过磁分离，游离的酶催化底物水解形成葡萄糖。(4)借助便携式血糖仪可对葡萄糖浓度进行测定，实现对于核酸的定量检测。该方法操作便携，无需大型仪器辅助，成本低廉，且选择性好、灵敏度高，具有一定的应用前景。具有一定的应用前景。具有一定的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法


[0001]本专利技术属于生物和化学领域，涉及一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法。

技术介绍

[0002]核酸检测是用分子生物学和生物化学的理论和技术，直接或间接探查核酸的存在状态或完整性，并从核酸的结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的结构与功能。而研究表明，除朊病毒之外的已知生物体内都含有核酸分子，因而核酸检测在生命遗传研究、传染病检测、遗传病诊断、肿瘤研究等多领域具有重要的应用价值。
[0003]目前应用最为广泛的核酸检测方法包括测序技术和核酸扩增技术。以针对SARS
‑
CoV
‑
2的核酸检测为例，Wu等人利用测序技术对病毒全基因组进行了表征，并与其它冠状病毒基因组序列进行了比对，为后续病毒核酸检测技术的发展奠定了基础。但基于测序技术的核酸检测方法对样品质量要求高，依赖于大型仪器，且工作周期长，难以实现快速便携式的核酸检测。此外，核酸扩增技术主要针对病毒RNA进行，包括逆转录PCR(RT
‑
PCR)，实时逆转录PCR(rRT
‑
PCR)，逆转录环介导等温扩增(RT
‑
LAMP)以及实时RT
‑
LAMP等。例如Noh等于靶向SARS
‑
CoV和MERS
‑
CoV保守的S基因的引物和探针，开发了一种RT
‑
PCR方法，可以实现高灵敏度的体外诊断，检出限达50
‑
100copies/mL。Shirato等，分别针对MERS
‑
CoV基因组中开放阅读框1ab基因和核壳蛋白N基因，构建了两套RT
‑
LAMP检测系统，实现了对来自不同MERS
‑
CoV株靶序列的高效扩增和检测。目前针对SARS
‑
CoV
‑
2的检测金标准也是通过实时荧光RT
‑
PCR，虽然以之为代表的核酸扩增技术灵敏度高，特异性强，检测时间较短，但仍存在一些不容忽视的缺陷，如该技术必须依赖专业仪器和设备，而且对操作人员的要求较高，因此在条件受限的环境下很难得到广泛应用。(Nature,2020,579(7798):265
‑
269.Archives of Virology,2017,162(6):1617
‑
1623.Journal of Virological Methods,2018,258:41
‑
48.Clinical Chemistry,2020,66(7):975
‑
977.Journal of Virological Methods,2020,283:113919.)
[0004]针对上述问题，张锋和Doudna等课题组于近年提出利用以CRISPR Cas系统为核心的核酸检测技术，利用其切割活性及报告基团可以对信号进行转导和放大，具有高灵敏度和高特异性。基于CRISPR Cas系统所构建的SHERLOCK和DETECTR等体系也被用于SARS
‑
CoV
‑
2的早期诊断中，但由于此类方法产生的荧光信号需要需荧光仪、酶标仪等大型仪器进行信号输出，难以广泛用于核酸靶标在基层上的即时检测。(Science,2017,356(6336):438
‑
442.Science,2018,360(6387):436
‑
439.New England Journal of Medicine,2020,383(15):1492
‑
1494.Cell,https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001.)

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服针对现有核酸检测技术的缺陷，借助CRISPR Cas系统以及功能化磁珠传感器，构建一种操作便携，无需大型仪器辅助，成本低廉，且选择性好、灵敏度高的新平台。为此，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
[0007]步骤一：借助核酸扩增技术(RT
‑
RPA、RT
‑
LAMP等)对核酸检测片段进行扩增；在对于SARS
‑
CoV
‑
2时，对NOS终止子中的检测片段进行扩增；
[0008]步骤二：在crRNA的介导下，Cas12a可特异性识别扩增产物，利用其核酸酶活性释放借助ssDNA偶联于磁珠上的各种具有催化水解产生葡萄糖功能的产糖酶(转化酶淀粉酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶等)；
[0009]步骤三：通过磁分离，游离的产糖酶水解其对应底物(蔗糖、淀粉、乳糖、葡聚糖等)，并产生葡萄糖。
[0010]步骤四：借助便携式血糖仪对葡萄糖信号进行快速读取。
[0011]其中，步骤二中，Cas12a浓度为25
‑
150nM，Cas12a与crRNA的浓度比为1:1
‑
1:4。
[0012]步骤三中，反应体系中底物浓度为0.10
‑
2.00M，葡萄糖氧化酶的浓度为2
‑
15U/mL。
[0013]步骤四中，市面上常见的血糖仪均能定量读取体系内的葡萄糖浓度。
[0014]进一步地，针对SARS
‑
CoV
‑
2基因组，RT
‑
RPA所扩增的目标扩增片段序列包括：
[0015]N1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.1序列：
[0016]5’‑
AUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCCCCCAGCGCUUCAGCGUUCUUCGGA
‑3’
；
[0017]N2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.2序列：
[0018]5’‑
UUGGAUGACAAAGAUCCAAAUUUCAAAGAUCAAGUCAUUUUGCUGAAUAA
‑3’
；
[0019]M1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.3序列：
[0020]5’‑
CAAUGGAACCUAGUAAUAGGUUUCCUAUUCCUUACAUGGAUUUGUCUUCU
‑3’
；
[0021]M2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.4序列：
[0022]5’‑
CUUGUUUUGUGCUUGCUGCUGUUUACAGAAUAAAUUGGAUCACCGGUGGA
‑3’
；
[0023]S1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.5序列：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一：借助核酸扩增技术对核酸检测片段进行扩增；步骤二：在crRNA的介导下，Cas12a可特异性识别扩增产物，利用其核酸酶活性释放借助ssDNA偶联于磁珠上的具有催化水解产生葡萄糖功能的产糖酶；步骤三：通过磁分离，游离的产糖酶水解其对应底物，并产生葡萄糖；步骤四：借助便携式血糖仪对葡萄糖信号进行快速读取。2.如权利要求1所述的一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法，其特征在于：当用于SARS
‑
CoV
‑
2检测时，步骤一中所用的扩增方法为RT
‑
RPA，目标扩增片段序列包括：N1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.1序列：5
’‑
AUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCCCCCAGCGCUUCAGCGUUCUUCGGA
‑3’
；N2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.2序列：5
’‑
UUGGAUGACAAAGAUCCAAAUUUCAAAGAUCAAGUCAUUUUGCUGAAUAA
‑3’
；M1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.3序列：5
’‑
CAAUGGAACCUAGUAAUAGGUUUCCUAUUCCUUACAUGGAUUUGUCUUCU
‑3’
；M2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.4序列：5
’‑
CUUGUUUUGUGCUUGCUGCUGUUUACAGAAUAAAUUGGAUCACCGGUGGA
‑3’
；S1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.5序列：5
’‑
CCCCCUGCAUACACUAAUUCUUUCACACGUGGUGUUUAUUACCCUGACAA
‑3’
；S2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.6序列：5
’‑
CGCCACCAGAUUUGCAUCUGUUUAUGCUUGGAACAGGAAGAGAAUCAGCA
‑3’
；E1
‑
Target，即序列表SEQ ID No.7序列：5
’‑
UAGUUAAUAGCGUACUUCUUUUUCUUGCUUUCGUGGUAUUCUUGCUAGUU
‑3’
；E2
‑
Target，即序列表SEQ ID No.8序列：5
’‑
AGCGUACUUCUUUUUCUUGCUUUCGUGGUAUUCUUGCUAGUUACACUAGC
‑3’
。3.如权利要求1所述的一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法，其特征在于：当用于SARS
‑
CoV
‑
2检测时，步骤二中所用的crRNA序列包括：N1
‑
crRNA，即序列表SEQ ID No.9序列：5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC
‑3’
；N2
‑
crRNA，即序列表SEQ ID No.10序列：5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAGAUCAAGUCAUUUUGCU
‑3’
；M1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，黄迪，石朱伟，方蒙君，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：