利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，包括在诱导重组酵母胞内表达黄曲霉尿酸氧化酶后，使菌体置于破胞缓冲液中破碎细胞；其中所述破胞缓冲液包含添加剂，所述添加剂选自二硫代苏糖醇、三(2

【技术实现步骤摘要】
利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法


[0001]本专利技术属于蛋白质表达与分离纯化领域，具体而言涉及一种利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法。

技术介绍

[0002]尿酸氧化酶(urate oxidase)是生物体内嘌呤代谢过程中的一种酶，可以催化尿酸生成尿囊素的反应。人类在进化过程中失去尿酸氧化酶，无法进一步降解尿酸。而由于尿酸较差的溶解性，其排泄较为困难，导致人类易患尿酸累积造成的疾病。
[0003]肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome，TLS)是大量的肿瘤细胞因化疗裂解产生的钾、磷、核酸和细胞因子超过机体自我平衡机制所能应对时出现的并发症。由于人体内无内源性的尿酸氧化酶，释放的核酸代谢产生的尿酸急剧升高，容易超过肾脏的排泄能力，导致尿酸盐结晶阻塞肾小管、诱发急性肾损伤并导致一系列的后续症状。TLS最常见于血液肿瘤化疗过程中，在其他实体瘤化疗中也有发生。TLS的产生将严重影响患者预后，并可能发生危及生命的急性肾衰。
[0004]早在上世纪，研究人员开始采用注射外源尿酸氧化酶的方式治疗TLS。1974年在法国上市的是由Sanofi开发的从其天然产生菌黄曲霉(Aspergillus flavus)中提取得到。具有良好的迅速降低血尿酸的效果，能够防止肾功能损伤或者恢复肾功能正常。但是黄曲霉并非高效的表达系统，且毒素较多，提取蛋白的纯度也很难保证。2001年，Sanofi公司开发的第一个重组黄曲霉尿酸氧化酶，即rasburicase在欧洲上市，次年在美国上市。Rasburicase是通过克隆黄曲霉尿酸氧化酶基因的cDNA在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统中以胞内可溶形式进行重组表达的产物，具有更高的纯度。Coiffier等将患者分为TLS的高风险、中风险和低风险人群，rasburicase被认为是高风险人群、别嘌呤醇预防失效的中风险人群预防和治疗TLS的一线用药(COIFFIER B,ALTMAN A,PUI C H,et al.Guidelines for the management of pediatric and adult tumor lysis syndrome:an evidence
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based review[J].J Clin Oncol,2008,26(16):2767
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78.)。
[0005]Sanofi公司采用酿酒酵母表达rasburicase，由于溶氧不足时酿酒酵母会产生乙醇，难以进行高密度发酵，表达水平不理想，价格昂贵。国内也进行了诸多仿制研究，主要利用原核表达系统进行表达，但原核系统存在无翻译后修饰等问题。毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年发展较快的表达系统，拥有较为完整的翻译后修饰体系，为表达特定蛋白提供了基础。但该表达方式也面临一些限制。如由于酵母菌细胞壁较原核生物厚度增加，而化学法、酶法、超声法、冻融法等裂解方法不适用于工业生产，需采用机械法使细胞破碎释放胞内蛋白，其中珠磨法的操作参数较多、优化较为复杂且有效能量交换率仅为1％左右(《生物分离工程》，第三版，孙彦著)；而高压匀浆法破胞压力需达到1800
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2000bar，对设备要求较高。此外，胞内蛋白在匀浆破碎过程中容易产生降解；胞内杂质如杂蛋白、核酸、脂质的释放也对目的蛋白的分离纯化造成了挑战。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，通过优化破胞缓冲液，抑制了破胞过程中黄曲霉尿酸氧化酶的降解。
[0007]为此，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，包括在诱导重组酵母胞内表达黄曲霉尿酸氧化酶后，使菌体置于破胞缓冲液中破碎细胞；其中所述破胞缓冲液包含添加剂，所述添加剂选自二硫代苏糖醇(DTT)、三(2
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羧乙基)膦、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或几种的组合；优选的，所述添加剂为二硫代苏糖醇或/和三(2
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羧乙基)膦。
[0009]在一些实施方案中，所述添加剂的浓度为100mM至2M，优选为100mM至1800mM、100mM至1600mM、100mM至1400mM、100mM至1200mM、100mM至1000mM、100mM至800mM、100mM至700mM、100mM至600mM、100mM至500mM、100mM至450mM、100mM至400mM、100mM至350mM、100mM至300mM、200mM至2M、200mM至1800mM、200mM至1600mM、200mM至1400mM、200mM至1200mM、200mM至1000mM、200mM至800mM、200mM至700mM、200mM至600mM、200mM至500mM、200mM至450mM、200mM至400mM、200mM至350mM、250mM至350mM、200mM至300mM、或250mM至300mM。在一些具体的实施方案中，所述添加剂的浓度为100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM或2000mM。
[0010]在一些实施方案中，本专利技术的添加剂为三(2
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羧乙基)膦。进一步的，所述三(2
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羧乙基)膦的浓度为100mM至2M，优选为100mM至1800mM、100mM至1600mM、100mM至1400mM、100mM至1200mM、100mM至1000mM、100mM至800mM、100mM至700mM、100mM至600mM、100mM至500mM、100mM至450mM、100mM至400mM、100mM至350mM、100mM至300mM、200mM至2M、200mM至1800mM、200mM至1600mM、200mM至1400mM、200mM至1200mM、200mM至1000mM、200mM至800mM、200mM至700mM、200mM至600mM、200mM至500mM、200mM至450mM、200mM至400mM、200mM至350mM、250mM至350mM、200mM至300mM、或250mM至300mM。在一些具体的实施方案中，所述三(2
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羧乙基)膦的浓度为100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM或2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，包括：在诱导重组酵母胞内表达黄曲霉尿酸氧化酶后，使菌体置于破胞缓冲液中破碎细胞；其中所述破胞缓冲液包含添加剂，所述添加剂选自二硫代苏糖醇、三(2
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羧乙基)膦、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或几种的组合。2.根据权利要求1所述的利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，所述添加剂为二硫代苏糖醇或/和三(2
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羧乙基)膦。3.根据权利要求1所述的利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，所述添加剂的浓度为100mM至2M，优选为200mM至2M，更优选为300mM。4.根据权利要求2所述的利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，所述二硫代苏糖醇或三(2
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羧乙基)膦的浓度为100mM至2M，优选为200mM至2M，更优选为300mM。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的利用酵母胞内表达制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，所述破胞缓冲液的缓冲成分为三羟甲基氨基甲烷
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盐酸、磷酸盐、硼酸
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【专利技术属性】
技术研发人员：冯军，路建光，王亚鹏，赵文杰，于敏，黄宗庆，赵伟，化浩举，杜萱，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院上海多米瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：