一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用，所述亚硝酸盐还原酶突变体是对植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶完整亲本序列基础上，删除蛋白序列中1

【技术实现步骤摘要】
一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体地说涉及一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]亚硝酸盐是自然界氮循环中的重要物质，广泛存在于土壤、水和植物中，是一种潜在的致癌物质。亚硝酸盐主要通过蔬菜食用进入人体，过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，孕妇过量摄入亚硝酸盐可导致胎儿畸形。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。在水产养殖中，亚硝酸盐会使鱼体内氧气减少从而影响鱼类的生理活动致其死亡。因此，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行。目前运用物理、化学方法降解亚硝酸盐仍具有成本高、见效慢、降解不彻底和二次污染等缺点。目前，生物降解能有效控制并降解亚硝酸盐，其中亚硝酸盐还原酶是生物降解过程发挥作用中的关键酶。
[0003]亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，简称为NIR)是一种脱氮反应中的关键酶，它脱氮过程有两种：(1)催化亚硝酸盐(NO2‑
)失去电子生成一氧化氮(NO)；(2)催化亚硝酸盐(NO2‑
)进行氨合并生成铵根离子(NH
4+
)。NIR根据结构类型可以分为细胞色素cd1型和铜型，其编码基因分别为nirS和nirK。菌株皮氏罗尔斯顿氏菌、蜡状芽孢杆菌、胃幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、乳酸菌和豌豆、玉米和玉米叶中均发现了NIRs。但野生菌中亚硝酸盐还原酶具有蛋白含量少、提取困难等缺点，难以进行规模化制备。目前，有大量报道利用基因工程技术得到重组表达的NIR。在对亚硝酸盐还原酶基因的克隆和表达的研究中，存在得到的酶蛋白表达量低、酶活力低、酶蛋白不稳定等问题，限制了其应用。
[0004]蛋白质理性设计是近年来新兴起的改变酶自身性质的有利工具，它建立在人们对酶结构与功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。随着结构生物学、分子动力学模拟等领域的发展，基于蛋白结构理性设计的蛋白质工程改造已经在很多酶中性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。但由于蛋白空间结构的复杂性，即使存在多种设计方案，找到一种酶活较高，且稳定性又好，能够有应用降解亚硝酸盐的前景的酶突变体并不容易。

技术实现思路

[0005]本专利技术需要解决的技术问题之一是提供可以重组表达并能得到较高酶活且稳定性较高的植物乳杆菌来源亚硝酸盐还原酶突变体。
[0006]解决上述技术问题的技术方案包括如下。
[0007]一种亚硝酸盐还原酶突变体，其是通过在氨基酸序列为SEQ ID NO:51的亲本序列基础上删除该序列中1
‑
16位共计16个氨基酸和删除533
‑
545位共计13个氨基酸，且在原有亲本序列基础上通过碱基突变引入两对二硫键所得。
[0008]在其中一些实施例中，所述亚硝酸盐还原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:49所示，或其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.49所示序列，且该序列存在一个或多个点突变，但生物活性不变。
[0009]本专利技术另一目的是提供一种编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因。
[0010]在其中一些实施例中，编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因为SEQ ID NO:50所示。
[0011]本专利技术的另一目的是提供一种插入有上述的编码亚硝酸盐还原酶突变体的基因的重组表达载体。
[0012]本专利技术的另一目的是提供一种含上述基因的重组基因工程菌。
[0013]本专利技术的另一目的是提供所述重组基因工程菌的制备方法，将上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因克隆到表达载体pET
‑
30a或pET
‑
21a表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
[0014]在其中一些实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，SHuffle T7或Arctic Express(DE3)。
[0015]本专利技术的另一目的是提供所述亚硝酸盐还原酶突变体的应用。
[0016]所述的亚硝酸盐还原酶突变体应用于食品、环保领域的亚硝酸盐降解中。
[0017]本专利技术的另一目的是提供一种亚硝酸盐降解的方法，降解亚硝酸盐时所用酶为上述的亚硝酸盐还原酶突变体。
[0018]本专利技术的专利技术人选择以植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶蛋白为模板，在此基础上进行理性设计系列突变体。专利技术人凭借多年的对酶突变体的研究经验，对亚硝酸盐还原酶的突变体进行构建、设计，并进行了重组表达，最终筛选改造获得了一株表达量、酶活力及酶稳定性均较野生型有大幅提高的亚硝酸盐还原酶突变体，进一步提高了该酶的应用范围。
[0019]与现有技术相比，本专利技术所述亚硝酸盐还原酶突变体具有如下有益效果：
[0020]本专利技术以构建得到的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组亚硝酸盐还原酶。以Na2S2O4‑
MV法测定野生型和突变体的酶活。结果表明相比于野生型，本专利技术制备得到的亚硝酸盐还原酶突变体(突变体编号21)
△1‑
16+
△
533
‑
545+F84C
‑
E367C+L479C
‑
Q515C相比野生型酶蛋白活力提高10倍左右，且在该酶最适反应温度条件下的半衰期提高9倍左右，酶蛋白表达量提高2.5倍。为亚硝酸盐还原酶工业化生产奠定了基础，在食品、环保等领域具有广泛应用前景。
具体实施方式
[0021]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0022]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0023]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的

的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0024]本专利技术亚硝酸盐还原酶突变体由氨基酸序列为SEQ ID No.51(GenBank：AKC01517.1)的植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶亲本序列基础上，设计删除蛋白序列中1
‑
16位共计16个氨基酸和533
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545位共计13个氨基酸，并且在此基础上通过在酶蛋白分子结构中引入二硫键所得。所述效果最好的亚硝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:49所示。2.一种编码权利要求1所述亚硝酸盐还原酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其为SEQ ID NO:50所示。4.一种插入有包括权利要求2或3所述的编码亚硝酸盐还原酶突变体的基因的重组表达载体。5.一种含权利要求2或3所述基因的重组基因工程菌。6.一种权利要求5所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述基因克隆到表达载体pET
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30...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永华，梁馨月，王方华，蓝东明，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：