一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术的巨噬细胞膜纳米囊泡，所述巨噬细胞膜过表达PD

【技术实现步骤摘要】
一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤是威胁人类生命与健康的最主要疾病之一，对我国人民生命和健康造成了严重威胁。肿瘤的传统治疗方法主要包括手术切除、放疗和化疗等，但这些治疗方法都具有一定的局限性，比如手术治疗无法解决非实体瘤，放疗和化疗具有极大副作用且易复发。近年来，癌症免疫疗法取得了令人瞩目的临床效果，并在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。癌症免疫治疗是一种通过激活人体内源的免疫系统来杀伤肿瘤细胞的治疗方式。目前肿瘤免疫治疗的研究主要集中于免疫检查点(Checkpoint)阻断剂疗法，肿瘤疫苗，过继性细胞疗法，并在临床上取得了显著的治疗效果。然而，这些免疫疗法都存在其一定的局限性：PD
‑
1单抗药物在临床治疗中的总体响应率低于30％，肿瘤疫苗目前还处于临床研究，而嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR
‑
T)细胞疗法仅在血液肿瘤中有较好的疗效。
[0003]T细胞在激活后表达PD
‑
1受体，作为一种刹车来限制自身免疫攻击。肿瘤细胞巧妙地利用这种负调控机制，通过表达程序性死亡配体1(programmed death ligand 1,PD
‑
L1)来逃避免疫监视，从而使T细胞衰竭，从而避免免疫消除。因此，免疫检查点阻断疗法(ICB)，一种用Nivolumab和Pembrolizumab等单克隆抗体阻断PD
‑
1/PD
‑
L1轴的策略，在各种类型的癌症中获得了前所未有的应答。但ICB治疗仍有一定的局限性，如临床应答率有限、治疗效果短暂、自身免疫攻击等。这些问题与免疫抑制肿瘤微环境(TME)有所关联。M2巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)等免疫抑制细胞总是被招募到肿瘤组织中，从而抑制T细胞活性。此外，外周核苷酸酶(CD39和CD73)在肿瘤细胞中的高表达导致了TME中腺苷的积累。腺苷与A
2a
腺苷受体(A
2a
R)结合，降低T细胞的抗肿瘤活性，促进调节性T细胞(Treg)的极化，进一步限制ICB治疗的疗效。此外，PD
‑
1抗体在临床治疗中可引起多种自身免疫攻击，包括心肌炎、甲状腺炎、1型糖尿病、结肠炎等，甚至危及患者的生命。因此，迫切需要提高应答率，同时减少免疫检查点抗体的毒性作用。除了单克隆抗体，小分子化合物药物也被开发来调节免疫细胞的活性。值得注意的是，化学药物靶向给药不仅能提高药物疗效，而且能降低毒副作用，包括外泌体在内的天然细胞膜泡被认为是药物输送的潜在载体。外泌体表现出良好的生物相容性、优异的载药能力和循环稳定性。然而，外泌体的产量太低，无法满足研究和临床治疗的需要。因此，采用挤压和超声方法制备了人工细胞膜纳米囊泡(NVs)。此外，与外泌体相比，细胞膜NVs的数量和大小更可控。特别是，NVs可以通过基因工程表达功能性蛋白，实现对癌症治疗的特异功能，因为这些NVs中的重组蛋白可以保持其完整的生物活性。此外，NVs可以靶向并浸润到特定的肿瘤中，从而促进其发挥作用。基于目前的免疫疗法存在的局限性，开发新型癌症免疫疗法有着迫切的临床需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种巨噬细胞膜纳米囊泡，所述巨噬细胞膜过表达PD
‑
1单链可变片段抗体，并负载腺苷受体拮抗剂。
[0006]研究表明，细胞膜囊泡可作为多种药物体内递送的载体，细胞膜囊泡由脂质、蛋白和少量糖类组成，表面的蛋白有助于提高其靶向性，具有良好的生物相容性，免疫原性低，有助于降低肝脏和肾脏对药物的清除，在血液中半衰期长，提高药物的生物利用度。本专利技术利用慢病毒感染的方法构建过表达PD
‑
1单链可变片段抗体的巨噬细胞系，并制得细胞膜纳米囊泡，并系统地研究了该细胞膜囊泡的理化表征、体外活性和体内抗肿瘤效应。
[0007]作为本专利技术所述的巨噬细胞膜纳米囊泡的优选实施方式，所述巨噬细胞为RAW 264.7细胞系。
[0008]研究表明，单核细胞/巨噬细胞可以被趋化因子(CSF1,CCL2)招募到肿瘤微环境。本专利技术利用巨噬细胞的肿瘤靶向能力，制备巨噬细胞来源的人工外泌体，以恢复“耗竭”的肿瘤特异性T细胞的功能。本申请专利技术人经大量的研究筛选验证发现，采用RAW 264.7细胞系制备过表达PD
‑
1单链可变片段抗体的细胞膜纳米囊泡，能够稳定表达aPD
‑1‑
scFv。
[0009]作为本专利技术所述的巨噬细胞膜纳米囊泡的优选实施方式，所述腺苷受体拮抗剂为A
2a
腺苷受体拮抗剂。
[0010]腺苷是癌细胞分泌的一种免疫抑制代谢物，腺苷与A
2a
腺苷受体(A
2a
R)结合，诱导降低T细胞的抗肿瘤活性，促进Treg的极化，进一步限制ICB治疗的疗效。本申请专利技术人经大量的研究筛选验证发现，NVs负载A
2a
腺苷受体(A
2a
R)拮抗剂CPI
‑
444，以协助T细胞拮抗腺苷，增加肿瘤浸润T细胞的密度和活性，直接抑制肿瘤进展和转移，为当前的联合PD
‑
1抗体疗法提供了新的思路。
[0011]作为本专利技术所述的巨噬细胞膜纳米囊泡的优选实施方式，所述A
2a
腺苷受体拮抗剂为CPI
‑
444。
[0012]作为本专利技术所述的巨噬细胞膜纳米囊泡的优选实施方式，所述CPI
‑
444的载药率为15.2％。
[0013]本申请专利技术人经研究发现，将0.5mg/mL的CPI
‑
444与aPD
‑1‑
scFv NVs孵育，能获得具有良好的载药能力的巨噬细胞膜纳米囊泡。
[0014]本专利技术还提供上述的巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)构建和扩增PD
‑
1单链可变片段抗体慢病毒载体质粒；
[0016](2)使用步骤(1)的质粒进行慢病毒包装，得PD
‑
1单链抗体病毒；
[0017](3)构建稳定过表达PD
‑
1单链可变片段抗体的巨噬细胞；
[0018](4)扩增培养步骤(3)的巨噬细胞，离心收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的PBS溶液重悬细胞，经过滤得过表达PD
‑
1单链可变片段抗体的巨噬细胞膜纳米囊泡；
[0019](5)将腺苷受体拮抗剂负载到过表达PD
‑
1单链可变片段抗体的巨噬细胞膜纳米囊泡，得所述巨噬细胞膜纳米囊泡。
[0020]本专利技术还提供所述的巨噬细胞膜纳米囊泡在制备免疫检查点抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种巨噬细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述巨噬细胞膜过表达PD
‑
1单链可变片段抗体，并负载腺苷受体拮抗剂。2.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述巨噬细胞为RAW 264.7细胞系。3.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述腺苷受体拮抗剂为A
2a
腺苷受体拮抗剂。4.根据权利要求3所述的巨噬细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述A
2a
腺苷受体拮抗剂为CPI
‑
444。5.根据权利要求3所述的巨噬细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述CPI
‑
444的载药率为15.2％。6.根据权利要求1～5任一项所述的巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建和扩增PD
‑
1单链可变片段抗体慢病毒载体质粒；(2)使用步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张旭东，梁欣，薛添元，孟繁蔷，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：