一种猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物，LAMP引物包括正向引物FIP、反向引物BIP、正向引物F3、反向引物B3、正向引物Loop F、反向引物Loop B，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～6所示。还提供了检测方法，提猕猴桃果实果皮的DNA，建立LAMP反应体系，将LAMP反应体系用矿物油封住液面后，在温度为65℃的条件下等温反应45min进行扩增，反应结束后加入10

A lamp primer for visual detection of Actinidia melanosis and its detection method

【技术实现步骤摘要】
NO:3所示，所述反向引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述正向引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物Loop B的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0006]本专利技术针对D.phaseolorum(即Diaporthe phaseolorum)的EF1
‑
a基因(OL702788)设计的LAMP引物序列；所述D.phaseolorum的EF1
‑
a基因核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
[0007]本专利技术还提供了上述的猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物进行猕猴桃黑点病菌检测的方法，该方法为：
[0008]S1、提猕猴桃果实果皮的DNA，得到待检测基因组DNA；
[0009]S2、用S1中得到的待检测基因组DNA建立LAMP反应体系，将所述LAMP反应体系用矿物油封住液面后，在温度为65℃的条件下等温反应45min进行扩增，反应结束后加入10
×
SYPR Green I染料；反应液呈荧光绿色表示含猕猴桃黑点病菌，呈褐色表示不含猕猴桃黑点病菌；
[0010]所述LAMP反应体系为：10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、100mmol
·
L
‑1的MgSO4溶液0.5μL、10mmol
·
L
‑1的dNTPs溶液3.5μL、10μmol
·
L
‑1的正向内引物FIP 4.0μL、10μmol
·
L
‑1的反向内引物BIP 4.0μL、10μmol
·
L
‑1的正向外引物F3 0.5μL、10μmol
·
L
‑1的反向外引物B3 0.5μL、10μmol
·
L
‑1的正向引物Loop F 1.0μL、10μmol
·
L
‑1的反向环引物Loop B 1.0μL、8U
·
μL
‑1的Bst DNA聚合酶溶液1.0μL、4mol
·
L
‑1的甜菜碱1μL、待检测基因组DNA1μL，ddH2O补足至25μL。
[0011]优选地，所述矿物油的用量为30μL，所述10
×
SYPR Green I染料的用量为1μL。
[0012]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0013]本专利技术以D.phaseolorum的EF1
‑
a基因(OL702788)作为靶标基因，设计LAMP特异性引物，建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法，并进行特异性、灵敏度试验和植物病残体检测。LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作过程简单、检测成本低、可视化的检测结果等优点，可以为快速检测田间病原菌提供技术支持，对该病害提早预测、及时制定病害防治策略和有效的防治可提供科学依据，并具有重要的指导意义和广阔应用前景及经济效益。
[0014]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。
附图说明
[0015]图1是本专利技术的实施例1的田间采回的猕猴桃果实部分的猕猴桃黑点病菌检测结果。
具体实施方式
[0016]实施例1
[0017]本实施例的猕猴桃黑点病菌(Diaporthe phaseolorum)可视化检测的LAMP引物，所述LAMP引物包括正向引物FIP、反向引物BIP、正向引物F3、反向引物B3、正向引物LoopF、反向引物LoopB；所述正向引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述正向引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述正向引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0018]本专利技术针对D.phaseolorum(即Diaporthe phaseolorum)的EF1
‑
a基因(OL702788)设计的LAMP引物序列；所述D.phaseolorum的EF1
‑
a基因核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
[0019]本实施例还提供了上述的猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物进行猕猴桃黑点病菌检测的方法，该方法为：
[0020]S1、提猕猴桃果实果皮的DNA，得到待检测基因组DNA；
[0021]S2、用S1中得到的待检测基因组DNA建立LAMP反应体系，将所述LAMP反应体系用30μL矿物油封住液面后，在温度为65℃的条件下等温反应45min进行扩增，反应结束后加入1μL 10
×
SYPR GreenI染料；反应液呈荧光绿色表示含猕猴桃黑点病菌(Diaporthe phaseolorum)(阳性反应)，呈褐色表示不含猕猴桃黑点病菌(阴性反应)；
[0022]所述LAMP反应体系为：10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、100mmol
·
L
‑1的MgSO4溶液0.5μL、10mmol
·
L
‑1的dNTPs溶液3.5μL、10μmol
·
L
‑1的正向内引物FIP 4.0μL、10μmol
·
L
‑1的反向内引物BIP 4.0μL、10μmol
·
L
‑1的正向外引物F3 0.5μL、10μmol
·
L
‑1的反向外引物B30.5μL、10μmol
·
L
‑1的正向引物Loop F 1.0μL、10μmol
·
L
‑1的反向环引物Loop B 1.0μL、8U
·
μL
‑1的Bst DNA聚合酶溶液1.0μL、4mol
·
L
‑1的甜菜碱1μL、待检测基因组DNA1μL，ddH2O补足至25μL。
[0023]从周至县广济镇、周至县钟南镇、周至县楼观镇、眉县汤峪镇、杨凌五泉镇田间采回的翠香果实随机取样，共计取样59个，其中病果49个，健康果实10个，病果DNA提取为病健交界处的果皮；健康果实取样为随机取样。并以健康果实为对照，提取果实表皮的DNA；根据室内病原菌检测技术体系进行检测。结果显示：病果检测呈荧光绿色(阳性反应)，健康果实和CK(灭菌的双蒸水)对照呈褐色(阴性反应)(图1)。检测准确率为100％。证明该病原菌检测技术体系方法有效、可行，完全可以用于猕猴桃黑点病菌田间样品检测。
[0024]DNA的提取方法为：
[0025]采用田间发病黑点病翠香果实和健本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括正向引物FIP、反向引物BIP、正向引物F3、反向引物B3、正向引物Loop F、反向引物Loop B；所述正向引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述正向引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述正向引物Loop F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物Loop B的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.一种用权利要求1所述的猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物进行猕猴桃黑点病菌检测的方法，其特征在于，该方法为：S1、提猕猴桃果实果皮的DNA，得到待检测基因组DNA；S2、用S1中得到的待检测基因组DNA建立LAMP反应体系，将所述LAMP反应体系用矿物油封住液面后，在温度为65℃的条件下等温反应45min进行扩增，反应结束后加入10
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SYPR GreenI染料；反应液呈荧光绿色表示含猕猴桃黑点病菌，呈褐色表示不含猕猴桃黑点病菌；所述LAMP反应体系为：10
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Isothermal Amplification Buffer 2...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦虎强，王丽，黄丽丽，刘巍，王娜娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：