一种检测接穗评价砧木优劣的芯片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种检测接穗评价砧木优劣的芯片及其制备方法与应用。应用本发明专利技术可以简便快速地评价砧木在耐热性、抗旱性、抗斑点落叶病、抗腐烂病、耐铁胁迫、耐磷酸盐胁迫等性能。本发明专利技术通过检测接穗端相应特性关键可传递异源mRNA的含量，对各种已知及未知的砧木进行对应性状评价，快速、高效地判定其优劣，对砧木育种和实地应用有重要意义。本发明专利技术操作简便快速、操作要求低、检测特异性强、结果准确、反应直观。直观。直观。

【技术实现步骤摘要】
一种检测接穗评价砧木优劣的芯片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体说是一种检测接穗评价砧木优劣的芯片及其制备方法和应用。尤指检测接穗评价苹果和梨砧木优劣的芯片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]嫁接是园艺作物最主要的无性繁殖方式，嫁接植株砧木与接穗之间存在着显著的相互作用，包括调控接穗的成花、果实产量和品质、植株生长发育、植株的抗性等。砧木对接穗表型的调控能力是评价砧木优劣的重要指标，优良的砧木能够提高植株抗病以及各种胁迫耐性等，决定了园艺作物产品的质量和产量，甚至整个植株的成活情况。对于砧木优劣的评价大多只关注于砧木方面，存在砧木抗性强则接穗抗性强这样一个武断认识的误区，然而实际的生产证明，砧木的抗性不一定都能够在接穗部有很好的体现，这就使得前期仅依靠砧木本身评价其优劣存在局限性和不确定性。果树生产的产量和品质，最终由接穗部决定，所以应通过直接评价嫁接后的接穗来评价砧木优劣。同时目前在实际生产中应用的砧木，一方面大多依靠当地原产砧木，另一方面引进外地、国外砧木，然而这些都需先进行生产试验，观察嫁接品种生长结果，对当地生态条件的适应能力，对病害的抵抗以及抗逆性等性状之后，才可应用于实际生产，过程繁琐且流程冗长。
[0003]砧木对接穗性状的调控是由于砧木通过嫁接运输部分砧木RNA分子至接穗，这些mRNA分子在植物抗逆、抗病虫害等方面能够起到重要作用，同时接穗部的生长发育、果实品质等方面也会受到来自于砧木部mRNA分子的调控，这些RNA分子从砧木到接穗的移动能力及移动量的多少可以作为评价砧木优劣的方式。
[0004]目前关于mRNA分子的鉴定方法，还停留在单纯的实验室分子鉴定水平上，包括常见的分子生物学技术如聚合酶链式反应PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片技术等。这些技术具有特异性强、检测量大、时间相对较短等优势，能够有效的对mRNA分子进行鉴定。但同时条件要求也较苛刻，如成本较高、需要实验室环境下专业人员操作等，非实验室条件下，农民只能通过长时间的选择和经验去判断，无法直接简便快速的应用于实际生产中，无法推广应用。因此，一种快速、低廉、高精度的由接穗部入手的检测手段亟待开发。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种检测评价砧木的芯片，以简便快速地评价砧木在耐热性、抗旱性、抗斑点落叶病、抗腐烂病、耐铁胁迫、耐磷酸盐胁迫等性能。
[0006]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一种检测接穗评价砧木优劣的芯片，其特征在于：芯片包括固相载体，固相载体上负载有体外反应试剂。
[0008]进一步，体外反应试剂包括混合缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、分子指纹探测器、焦碳酸二乙酯、颜色指示试剂。
[0009]上述混合缓冲液可以由E6800 体外蛋白合成试剂盒(NEB公司)提供
[0010]进一步，颜色指示试剂为氯酚红
‑
β
‑
D
‑
半乳吡喃糖。
[0011]进一步，分子指纹探测器为RNA序列，包括分子指纹探测器前端的颜色激发序列、与颜色激发序列碱基相匹配的经过扩增的诱导RNA序列，其核苷酸序列为序列表中编号为SEQ ID NO.3
‑
4，SEQ ID NO.38
‑
41所示序列。
[0012]本专利技术的另外一个目的在于提供一种制备如上所述芯片的方法。
[0013]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0014]一种制备检测接穗评价砧木优劣的芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0015]步骤一、向质粒中加入正向引物和反向引物，PCR预混液和水进行PCR扩增；
[0016]上述PCR预混液可以为2
×
Taq MasterMix(Dye)；
[0017]步骤二、将步骤一得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳，得到DNA回收产物，即分子指纹探测器；
[0018]步骤三、应用步骤二得到的分子指纹探测器，配制体外蛋白反应试剂；
[0019]步骤四、将步骤三得到的体外蛋白反应试剂加入至固相载体中得到芯片；
[0020]进一步，步骤一中所述正向引物和反向引物的核苷酸序列为序列表中编号为SEQ ID N0.11
‑
14，SEQ ID N0.31
‑
38所示序列。
[0021]进一步，步骤三中所述的体外蛋白反应试剂配制过程为：将混合缓冲液、RRI、分子指纹探测器、焦碳酸二乙酯、颜色指示试剂混合。
[0022]上述RRI可以为RNA guard
TM
[0023]进一步，步骤三中所述的体外反应试剂配制条件为：在37℃下培育2h。
[0024]本专利技术的又一个目的在于提供一种如上所述检测接穗评价砧木优劣的芯片的应用。
[0025]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0026]一种如前所述检测评价砧木的芯片的应用，其特征在于，包括如下步骤：
[0027]步骤一、采集砧木接穗韧皮部RNA；
[0028]步骤二、以上述RNA为模板，扩增出诱导RNA，具体为：
[0029]将韧皮部RNA、焦碳酸二乙酯、RRI加入诱导RNA扩增体系中进行反应得到诱导RNA；上述诱导RNA扩增体系包括五组分缓冲液、NTP混合液、dNTP混合液、酶混合物、引物混合物；
[0030]步骤三、将步骤二得到的诱导RNA加入芯片中进行体外蛋白反应；
[0031]步骤四、观察反应变色现象，评价待测接穗对应性状，进而评价砧木优劣。
[0032]进一步，
[0033]步骤二中所述五组分缓冲液的组分为：
[0034]三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇和水；
[0035]步骤二中所述酶混合物的组分为：
[0036]M
‑
MLV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶、核糖核酸酶、牛血清蛋白；
[0037]步骤二中所述引物混合物的组分为：
[0038]引物(R)、引物(F)、二甲基亚砜、去离子水。
[0039]进一步，步骤四中所述的变色现象的评价过程为：
[0040]使用摄像设备在相同拍摄条件下拍摄颜色指示试剂环境颜色的第一颜色向第二颜色变化的过程，并记录第一颜色向第二颜色转变所需时间，即反应时间；
[0041]使用软件读取第一颜色向第二颜色改变过程中RGB值的变化，并根据以下公式计算颜色变化率CCT：
[0042]C＝(R+B)/(R+G)；
[0043]ΔC＝d[dC/dt]/dt＝d2(R+B)/(R+G)/dt2；
[0044]CCT＝ΔC
×
105：
[0045]式中，C：颜色指示试剂环境颜色，R：RGB红色数值，G：RGB绿色数值，B：RGB蓝色数值，ΔC：曲线斜率变化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测接穗评价砧木优劣的芯片，其特征在于：芯片包括固相载体，固相载体上负载有体外反应试剂。2.如权利要求1所述的一种检测接穗评价砧木优劣的芯片，其特征在于：体外反应试剂包括混合缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、分子指纹探测器、焦碳酸二乙酯处理水、颜色指示试剂。3.如权利要求2所述的一种检测接穗评价砧木优劣的芯片，其特征在于：颜色指示试剂为氯酚红
‑
β
‑
D
‑
半乳吡喃糖。4.如权利要求2所述的一种检测接穗评价砧木优劣的芯片，其特征在于：分子指纹探测器为RNA序列，包括分子指纹探测器前端的颜色激发序列、与颜色激发序列碱基相匹配的经过扩增的诱导RNA序列，其核苷酸序列为序列表中编号为SEQ ID NO.3
‑
4，SEQ ID NO.39
‑
42所示序列。5.一种制备如权利要求4所述芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、向质粒中加入正向引物和反向引物，PCR预混液和水进行PCR扩增；步骤二、将步骤一得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳，得到DNA回收产物，即分子指纹探测器；步骤三、应用步骤二得到的分子指纹探测器，配制体外蛋白反应试剂；步骤四、将步骤三得到的体外蛋白反应试剂加入至固相载体中得到芯片。6.如权利要求5所述的一种芯片制备方法，其特征在于：步骤一中所述正向引物和反向引物的核苷酸序列为序列表中编号为SEQ ID NO.11
‑
14，SEQ ID NO.31
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38所示序列。7.如权利要求5所述的一种芯片制备方法，其特征在于：步骤三中所述的体外蛋白反应试剂配制过程为：将混合缓冲液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，张川，王圣元，王胜男，姜峰，孙世岳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：