重组C反应蛋白制造技术

在应用乳胶试剂的免疫测定中，提高CRP高浓度范围中的免疫测定的正确性。重组C反应蛋白，其为通过基因重组生产的C反应蛋白，该C反应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组C反应蛋白


[0001]本专利技术涉及通过基因重组技术生产的C反应蛋白(C
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reactive protein；下文也显示为“CRP”)及其用途。更详细地，涉及变换了CRP的N末端结构的重组CRP、和应用该重组CRP的校准品、管理血清、和通过抗体抗原反应的CRP的定量方法。

技术介绍

[0002]CRP是与肺炎球菌荚膜的C多糖显示沉淀反应的蛋白，此外由于是急性期蛋白的一种也已知为代表性的炎症标记物。在感染病和炎症性疾病中，由于CRP的血中浓度显著增加、此外伴随病情恢复急剧减少，CRP的定量成为各种疾病的重症程度的判定、治疗经过观察时的指标。健康人的血中的CRP浓度通常是0.3mg/dL以下，但对于炎症和炎症性疾病的患者的情形，在短时间急增至数百至数千倍。因此，在样品中的CRP测定中，需要正确测定低浓度至高浓度的广范围浓度的CRP。
[0003]作为临床检查领域中的血中CRP浓度的定量法，有利用抗原抗体反应的测定方法，已知酶免疫测定法、发光免疫测定法、乳胶免疫比浊法、免疫色谱法等。尤其地，在这些测定方法中，乳胶免疫比浊法由于操作简便且通过分析装置的测定可自动化而广泛用于日常检查。在乳胶免疫比浊法中，从应用浓度已知的校准品的校准曲线定量CRP浓度，此外该校准曲线的正确性通过管理血清的测定保证。
[0004]在上述的校准品和管理血清中，使用从腹水等人体液纯化的天然型CRP，但存在混入CRP以外的血清成分、对血中CRP浓度的测定造成影响的风险。此外，在CRP的分离、纯化阶段，由于处理成为生物体原料的人体液，也有病原性的二次感染的风险，制备中的安全性也有问题。进一步，人体液中的CRP含量中有偏差，从稳定供给方面也有问题。另一方面，利用微生物等的重组CRP由于不以人体液为原料，不存在来自人的血清成分的混入和二次感染的风险，因此，如果可以构建通过基因工程技术的重组蛋白的稳定表达系统，可以稳定供给靶蛋白。
[0005]关于通过微生物的重组CRP的表达，已经报告应用大肠杆菌和酵母等的成功实例(专利文献1，非专利文献1)。但是，在通过乳胶免疫比浊法的重组CRP浓度的测定中，在CRP高浓度范围，存在检测到比实际的CRP浓度低的测定值的问题。因此，在校准品和管理血清等中使用重组CRP作为诊断药原料中，需要提高CRP高浓度范围中的测定的正确性。
[0006]多种蛋白通过翻译后修饰引起化学特性或结构的变换。作为翻译后修饰之一，有谷氨酰胺或谷氨酸的羧基与氨基通过产生分子内缩合反应变换为焦谷氨酸的焦谷氨酰化。动植物具有大量通过焦谷氨酰化修饰的焦谷氨酰肽，存在β
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淀粉样蛋白、胶原蛋白、IgG2等蛋白。CRP也是焦谷氨酰肽。但是，据报告，重组CRP中混合N末端保持为谷氨酰胺的那种、和变换为焦谷氨酸的那种(非专利文献2)。关于这样的CRP的N末端结构与乳胶免疫比浊法中的抗体抗原反应的关联，迄今没有报告。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1：特开2000
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14388号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1：TOSHIO TANAKA et a1.，BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN.，295(2002)，p163
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166
[0012]非专利文献2：临床检查，Vol.46，No.9，p973
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981(2002年9月)
[0013]专利技术概述
[0014]专利技术要解决的问题
[0015]本专利技术的问题是，尤其在应用乳胶免疫比浊法的情形中，提高CRP高浓度范围中的测定的正确性。
[0016]用于解决问题的手段
[0017]本专利技术人鉴于上述情况进行深入研究，结果发现了通过变换重组CRP的N末端结构克服上述问题的方法。具体地，发现通过应用经完整MS测定、全部的55％以上的N末端被焦谷氨酰化的重组CRP，可正确测定CRP高浓度范围中的CRP浓度，从而完成本专利技术。
[0018]作为本专利技术的具体方式，如下所示。
[0019]第1项.重组C反应蛋白，其为通过基因重组生产的C反应蛋白，该C反应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。
[0020]第2项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的65％以上的N末端被焦谷氨酰化。
[0021]第3项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的75％以上的N末端被焦谷氨酰化。
[0022]第4项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的85％以上的N末端被焦谷氨酰化。
[0023]第5项.第1至4项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，重组C反应蛋白是通过细菌进行的重组蛋白。
[0024]第6项.第5项记载的重组C反应蛋白，其中，细菌是大肠杆菌。
[0025]第7项.第1至6项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白来自人。
[0026]第8项.第1至7项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白由下述的(a)至(c)的任一种多肽组成：
[0027](a)序列编号1或序列编号2记载的多肽，
[0028](b)由在序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成，并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽，
[0029](c)由与序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列的同一性是90％以上的氨基酸序列组成、并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽。
[0030]第9项.校准品，其包含第1至8项的任一项记载的C反应蛋白。
[0031]第10项.管理血清，其包含第1至8项的任一项记载的C反应蛋白。
[0032]第11项.定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用第9项记载的包含C反应蛋白的校准品。
[0033]第12项.定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用第10项记载的包含C反应蛋白的管理血清。
[0034]第13项.第11或12项记载的定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用固定了抗C反应蛋白抗体的乳胶粒子，通过乳胶免疫比浊法进行。
[0035]专利技术效果
[0036]本专利技术的重组CRP可以提高通过乳胶免疫比浊法的CRP高浓度范围中的测定的正确性，用作管理血清或校准品中应用的诊断药用原料。
[0037]附图简述
[0038][图1]是显示实施例3中进行重组CRP1的SDS
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PAGE的结果的图。
[0039][图2]是显示实施例3中进行重组CRP2的SDS
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PAGE的结果的图。
[0040][图3]是显示实施例5中进行放大各种CRP1的LC/MS的洗脱时间1.7～2.0分钟的平均的10价离子的谱的比较研究的结果的图。
[0041][图4]是显示实施例5中进行放大各种CRP2的LC/MS的洗脱时间1.7～本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.重组C反应蛋白，其为通过基因重组生产的C反应蛋白，所述C反应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。2.权利要求1所述的重组C反应蛋白，其中，所述C反应蛋白的65％以上的N末端被焦谷氨酰化。3.权利要求1所述的重组C反应蛋白，其中，所述C反应蛋白的75％以上的N末端被焦谷氨酰化。4.权利要求1所述的重组C反应蛋白，其中，所述C反应蛋白的85％以上的N末端被焦谷氨酰化。5.权利要求1至4的任一项所述的重组C反应蛋白，其中，重组C反应蛋白是通过细菌进行的重组蛋白。6.权利要求5所述的重组C反应蛋白，其中，细菌是大肠杆菌。7.权利要求1至6的任一项所述的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白来自人。8.权利要求1至7的任一项所述的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白由下述(a)至(c)的任一种多肽组成：(a)序列编号1或序...

【专利技术属性】
技术研发人员：三岛朱加，角田洋辅，
申请(专利权)人：东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：