表皮生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子技术

本发明专利技术涉及治疗性mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子。更具体地，本发明专利技术提供了一种核酸分子，其从5

【技术实现步骤摘要】
表皮生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子


[0001]本公开一般地涉及分子生物学领域，更具体地涉及表皮生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子。

技术介绍

[0002]信使RNA(mRNA)是一种相对较新的治疗性分子，其具有广泛的临床应用潜力，包括癌症治疗、疫苗和再生疗法。与基于重组蛋白的药物相比，基于mRNA的药物的优势包括：1.生产具有成本效益；2.更长的治疗效果；3.快速合成和纯化；4.无内毒素和传染原；5.翻译后修饰是有利的。mRNA也是基因治疗的一种非常有益的替代方法，因为它并未基因整合到基因组中，不需要进入细胞核，并且表达是可直接控制的。总体而言，基于mRNA的疗法是安全且具有成本效益的。
[0003]尽管基于mRNA的疗法是有希望的，但是mRNA的稳定性以及将mRNA递送至细胞的能力是不良的。
[0004]表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。表皮生长因子是一种小肽，其广泛存在人体多种组织，具有促进角化细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等细胞的生长作用。
[0005]因此，在本领域中对于改进的体外RNA转录方法以及更加稳定的mRNA例如表皮生长因子mRNA仍然存在需求。

技术实现思路

[0006]在一个方面中，本公开提供了一种RNA核酸分子，其从5
’
端到3
’
端包含或由下列组成：5/>’‑
帽结构、人β
‑
珠蛋白5
’
非翻译区(5
’‑
UTR)、至少一个编码区、人α
‑
珠蛋白3
’
非翻译区(3
’‑
UTR)和3
’‑
聚腺苷酸尾，所述至少一个编码区可操作地连接到所述5
’‑
UTR和所述3
’‑
UTR。
[0007]在一个实施方案中，所述编码区编码至少一种目的多肽或蛋白质，所述目的多肽或蛋白质任选地选自生长因子、抗原性多肽或蛋白质、变应原性多肽或蛋白质、治疗性多肽或蛋白质，或前述种类的片段、变体或衍生物。在一个实施方案中，所述编码区编码表皮生长因子，例如人表皮生长因子。
[0008]在一个实施方案中，所述编码区还编码选自下列的至少一种：信号肽、肽标签或蛋白质标签、定位信号或定位序列、和肽接头。
[0009]在一个实施方案中，所述5
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：1的RNA序列，或与根据SEQ ID NO：1的RNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的RNA序列。
[0010]在一个实施方案中，所述3
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：2的RNA序列，或与根据SEQ ID NO：2的RNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同
一性的RNA序列。
[0011]在一个实施方案中，所述5
’‑
帽结构是5
’‑
抗反向帽类似物(5
’‑
ARCA)，优选地所述5
’‑
ARCA是7m G(3
’‑
O
‑
Me)pppG。
[0012]在一个实施方案中，所述3
’‑
聚腺苷酸尾包含10个至200个、20个至100个、40个至80个、或50个至70个腺嘌呤核苷酸。
[0013]在另一个方面中，本公开提供了一种DNA核酸分子，其从5
’
端到3
’
端包含或由下列组成：启动子、人β
‑
珠蛋白5
’‑
非翻译区(5
’‑
UTR)、至少一个编码区、人α
‑
珠蛋白3
’‑
非翻译区(3
’‑
UTR)和转录终止子，所述至少一个编码区可操作地连接到所述5
’‑
UTR和所述3
’‑
UTR。
[0014]在一个实施方案中，所述编码区编码至少一种目的多肽或蛋白质，所述目的多肽或蛋白质任选地选自肽生长因子、抗原性多肽或蛋白质、变应原性多肽或蛋白质、治疗性多肽或蛋白质，或前述种类的片段、变体或衍生物。在一个实施方案中，所述编码区编码表皮生长因子，例如人表皮生长因子。
[0015]在一个实施方案中，所述编码区还编码选自下列的至少一种：信号肽、肽标签或蛋白质标签、定位信号或定位序列、和肽接头。
[0016]在一个实施方案中，所述启动子选自T3、T7、Sny5或SP6启动子。
[0017]在一个实施方案中，所述启动子选自是T3启动子，并且所述转录终止子选自T7转录终止子。
[0018]在一个实施方案中，所述5
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：3的DNA序列，或与根据SEQ ID NO：3的DNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的DNA序列。
[0019]在一个实施方案中，所述3
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：4的DNA序列，或与根据SEQ ID NO：4的DNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的DNA序列。
[0020]在一个实施方案中，所述DNA核酸分子进一步包含位于所述启动子上游的第一限制性酶切位点和位于所述转录终止子下游的第二限制性酶切位点。
[0021]在一个实施方案中，所述DNA核酸分子进一步包含位于所述启动子和所述5
’‑
UTR之间的第三限制性酶切位点和位于所述3
’‑
UTR和所述转录终止子之间的第四限制性酶切位点。
[0022]在又一个方面中，本公开提供了一种体外转录方法，其包括步骤：
[0023](a)提供本公开所述的DNA核酸分子作为转录模板；
[0024](b)任选地，扩增所述DNA核酸分子；
[0025](c)将所述DNA核酸分子在5
’‑
抗反向帽类似物(5
’‑
ARCA)、优选7m G(3
’‑
O
‑
Me)pppG
[0026]存在的情况下进行体外转录，以获得包含5
’‑
ARCA封端的mRNA的反应混合物；
[0027](d)任选地，通过添加DNA酶去除所述包含5
’‑
ARCA封端的mRNA的反应混合物中的转录模板；和
[0028](e)向所述包含5
’‑
ARCA封端的mRNA的反应混合物添加聚腺苷酸聚合酶反应混合物进行3
’‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA核酸分子，其从5
’
端到3
’
端包含5
’‑
帽结构、人β
‑
珠蛋白5
’
非翻译区(5
’‑
UTR)、至少一个编码区、人α
‑
珠蛋白3
’
非翻译区(3
’‑
UTR)和3
’‑
聚腺苷酸尾，所述至少一个编码区可操作地连接到所述5
’‑
UTR和所述3
’‑
UTR，所述编码区编码表皮生长因子(EGF)。2.根据权利要求1所述的RNA核酸分子，其中所述编码区还编码选自下列的至少一种：信号肽、肽标签或蛋白质标签、定位信号或定位序列、和肽接头。3.根据权利要求1或2所述的RNA核酸分子，其中所述5
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：1的RNA序列，或与根据SEQ ID NO：1的RNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的RNA序列；和/或其中所述3
’‑
UTR包含或组成为根据SEQ ID NO：2的RNA序列，或与根据SEQ ID NO：2的RNA序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的RNA序列。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的RNA核酸分子，其中所述5
’‑
帽结构是5
’‑
抗反向帽类似物(5
’‑
ARCA)，优选地所述5
’‑
ARCA是7m G(3
’‑
O
‑
Me)pppG。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的RNA核酸分子，其中所述3
’‑
聚腺苷酸尾包含10个至200个、20个至100个、40个至80个、或50个至70个腺嘌呤核苷酸。6.一种DNA核酸分子，其从5
’
端到3
’
端包含启动子、人β
‑
珠蛋白5
’‑
非翻译区(5
’‑
UTR)、至少一个编码区、人α
‑
珠蛋白3
’‑
非翻译区(3
’‑
UTR)和转录终止子，所述至少一个编码区可操作地连接到所述5
’‑
UTR和所述3
’‑
UTR，所述编码区...

【专利技术属性】
技术研发人员：邝纬阳，林庭匡，
申请(专利权)人：麦塞拿治疗香港有限公司，
类型：发明
国别省市：