一种全脑过表达核易位人源α-突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法技术

本发明专利技术公开一种全脑过表达核易位人源α

【技术实现步骤摘要】
一种全脑过表达核易位人源
α
‑
突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及全脑过表达核易位人源α
‑ꢀ
突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法。

技术介绍

[0002]1997年，Spllantini等人报道，SNCA编码的α
‑
突触核蛋白(alphasynuclein,α
‑
Syn)是帕金森病(Parkinson
’
s disease,PD)主要病理—路易小体的主要组成成分，随后又有研究报道SNCA基因的突变型(A30P,E46K,H50Q,G51D,A53E,A53T)和其二倍体、三倍体均能诱导PD的发生，表明SNCA基因在PD的病理进程中发挥着重要的作用。α
‑
Syn因其最初发现存在于突触前神经末梢和核膜周围而得名，随后的研究证实其在细胞系、果蝇、转基因小鼠及阿尔茨海默症和 PD患者脑组织中均存在核定位的现象。核易位的α
‑
Syn被证实能与 DNA相互作用，引起DNA损伤，引发神经毒性，造成神经元的死亡。表明核易位的α
‑
Syn参与PD的发生发展过程。因此，基于核易位α
‑
Syn细胞模型和动物模型的建立用于研究PD病理机制以及药物筛选成为亟待解决的关键问题。
[0003]相比较传统的毒素模型和转基因动物模型，采用定位注射重组腺相关病毒(rAAV)递送的α
‑
Syn构建α
‑/>Syn局部过表达动物模型，能初步复现PD的原发性运动障碍及部分多巴胺鞥神经元损伤，因此备受研究者的关注。然而，由于其基因组不整合的特点只能实现局部过表达。
[0004]现有技术中，α
‑
突触核蛋白缺乏核输入信号，还无法在核内过表达。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种全脑过表达核易位人源α
‑
突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法，以解决现有技术采用重组腺相关病毒 (rAAV)递送基因时，由于不整合基因组而只能实现局部过表达的问题，以及解决α
‑
突触核蛋白缺乏核输入信号，无法在核内过表达的问题。
[0006]本专利技术通过下列技术方案实现本专利技术目的：一种全脑过表达核易位人源α
‑
突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法，经过下列各步骤：
[0007]第一步：通过引物设计，引入3个重复序列的核易位信号肽 (3*NLS)，通过PCR方法获取人源核易位α
‑
Syn(α
‑
Syn
‑
3*NLS) 序列；所述核易位信号肽序列为CCAAAAAAGAGAAAGGTA；
[0008]第二步：以AAV过表达病毒载体pAAV
‑
IRES
‑
hrGFP为基本骨架，通过双酶切位点SalⅠ和Xhol将目的序列α
‑
Syn
‑
3*NLS构建入载体中，通过DNA测序方法确定基因序列准确插入，命名重组质粒为 AAV
‑
α
‑
Syn
‑
3*NLS；
[0009]第三步：采用293T对AAV
‑
α
‑
Syn
‑
3*NLS质粒进行病毒包装，得到过表达核易位α
‑
Syn的rAAV载体；包装病毒感染SH
‑
SY5Y细胞后，采用免疫荧光方法和Western blot方法对
病毒包装进行验证；验证表达和包装方法无误的过表达核易位α
‑
Syn的rAAV病毒进行浓缩和病毒滴度测定；
[0010]第四步：对乳鼠侧脑室定位注射过表达核易位α
‑
Syn的rAAV载体，滴度为1
×
10
13
vector genome(vg)/ml，获得全脑过表达核易位人源α
‑
突触核蛋白转基因鼠。
[0011]采用免疫荧光染色方法和Western blot方法检测各脑区的核易位α
‑
Syn表达情况，验证全脑过表达核易位人源α
‑
突触核蛋白转基因小鼠构建是否成功。
[0012]工作原理：本专利技术，基于目前研究核易位α
‑
Syn在PD中的功能作用，通过PCR方法引入3个重复的核易位信号序列(NLS)，获取编码核易位的α
‑
Syn(α
‑
Syn
‑
3*NLS)的基因序列。并通过载体构建获得过表达核易位的α
‑
Syn的rAAV病毒载体，提供一种增强型核易位α
‑
Syn载体的构建方法。通过病毒包装，将10
13
vg/ml的病毒颗粒通过侧脑室定位注射乳鼠，注射后14d，可成功获得全脑过表达核易位的α
‑
突触核蛋白的转基因小鼠，为开展研究核易位的α
‑
突触核蛋白与PD的病理机制提供研究工具。有益效果：
[0013](1)本专利技术过向胎鼠或乳鼠脑室内注射rAAV来实现整个中枢神经系统的基因过表达，实现了核易位α
‑
Syn的表达，通过免疫荧光确认了α
‑
Syn的细胞定位，明显定位为核内，可通过此过表达载体构建核易位α
‑
Syn细胞模型和动物模型。
[0014](2)本专利技术通过侧脑室脑立体定位的方法，实现了全脑过表达核易位α
‑
Syn的转基因小鼠模型。
附图说明
[0015]图1为本专利技术使用的rAAV载体图谱；
[0016]图2为本专利技术采用荧光显微镜10倍镜下观察包装的rAAV感染 293T细胞72h后的荧光效果；
[0017]图3为本专利技术采用Western blot方法检测核易位α
‑
Syn的rAAV 表达情况；
[0018]图4为本专利技术采用免疫荧光方法检测核易位α
‑
Syn在细胞中的定位情况；
[0019]图5为本专利技术定位注射示意图；
[0020]图6为本专利技术免疫荧光方法检测定位侧脑室注射乳AAV
‑
α
‑
Syn
ꢀ‑
3*NLS两周后，小鼠全脑切片中α
‑
Syn的表达情况；
[0021]图7为本专利技术免疫荧光方法检测定位注射乳鼠侧脑室过表达核易位α
‑
Syn的rAAV两周后小鼠中脑中核易位α
‑
Syn的表达情况检测；
[0022]图8为本专利技术Western blot方法检测过表达核易位α
‑
Syn转基因鼠各脑区中α
‑
Syn的表达情况；
[0023]图9为本专利技术技术路线。
具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全脑过表达核易位人源α
‑
突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过引物设计，引入3个重复序列的核易位信号肽，通过PCR方法获取人源核易位α
‑
Syn，即α
‑
Syn
‑
3*NLS序列；所述核易位信号肽序列为CCAAAAAAGAGAAAGGTA；（2）以AAV过表达病毒载体pAAV
‑
IRES
‑
hrGFP为基本骨架，通过双酶切位点SalⅠ和Xhol将目的序列α
‑
Syn
‑
3*NLS构建入载体中，通过DNA测序方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正存，马开利，李国祥，杜廷福，黄璋琼，潘玥，胡鹏，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：