编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA、及其应用制造技术

本发明专利技术提供了编码蛋白PANX1的mRNA以及编码蛋白PANX1变体PANX1

MRNA encoding protein panx1 and its variant panx1-ts, and its application

【技术实现步骤摘要】
编码蛋白PANX1和其变体PANX1
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TS的mRNA、及其应用


[0001]本专利技术属于PANX1基因治疗
，涉及编码蛋白PANX1和其变体PANX1
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TS的mRNA以及其在制备药物中的应用。

技术介绍

[0002]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染是导致器官移植患者术后死亡的重要原因之一。与等其他供体器官移植相比，肝移植患者感染MRSA的风险最高。高达23％的患者发生肝移植后MRSA感染，感染者的30天死亡率高达21％。在临床上，侵入性操作、胆道并发症和广谱抗生素的使用已经确定为MRSA感染的高危因素。在基因水平，目前的研究发现C7和MBL2等几个基因在受者术后感染中起重要作用。此外，肝脏不仅是代谢器官，也是最大的免疫器官，肝移植后受者的免疫状态可能受供者而非受者的肝脏影响。因此，供体肝脏中的遗传易感风险因素，尤其是那些涉及先天免疫防御的风险因素，可能会增加肝移植后MRSA感染的易感性。
[0003]目前，基因的递送技术通常利用病毒载体及非病毒载体。其中，非病毒载体的mRNA递送技术具有很高的应用潜力。mRNA的生产过程主要是基于线性化的质粒DNA为模板，然后体外转录合成相应的mRNA，在通过两端的加帽及加poly(A)。与其他递送技术相比，mRNA生产简单，成本不高；mRNA表达蛋白的速度快，跳过了DNA转录过程；mRNA不会整合到细胞基因组长，具有较高的临床安全性。目前，利用mRNA作为病毒疫苗或肿瘤疫苗已成为研究的热点。
[0004]但是现有技术并未有通过mRNA递送技术将PANX1基因或其变体递送给供体肝脏以实现抑制肝移植后的病原菌尤其是MRSA感染的记载。

技术实现思路

[0005]为了克服上述技术问题，本专利技术提供了编码蛋白PANX1的mRNA或编码蛋白PANX1变体PANX1
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TS的mRNA
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TS，通过使用一条mRNA即可表达PANX1基因编码的蛋白PANX1或其变体PANX1
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TS，同时只需要体外转录及脂质体包裹就能制备表达mRNA药物，起到有效预防肝移植后受体病原菌尤其是MRSA的感染。
[0006]本专利技术第一方面，提供了编码蛋白PANX1的mRNA，所述mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]进一步地，本专利技术还提供了含有上述mRNA的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.3。
[0008]本专利技术第二方面，提供了编码蛋白PANX1变体PANX1
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TS的mRNA
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TS，所述mRNA
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TS的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，本专利技术还提供了含有上述mRNA
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TS的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]本专利技术第三方面，提供了工程化细胞，所述工程化细胞中含有上述第一方面或第
二方面中的重组表达载体。
[0011]本专利技术第四方面，还提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中包含本专利技术第一方面中编码蛋白PANX1的mRNA或本专利技术第二方面中编码蛋白PANX1变体PANX1
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TS的mRNA
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TS。
[0012]进一步地，所述脂质体包括但不限于，DMG
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PEG2000，胆固醇，DODAP。
[0013]本专利技术第五方面，还提供了一种降低肝移植后受体病原菌感染的药物，所述药物包含本专利技术第四方面所述的脂质纳米颗粒。
[0014]本专利技术第六方面，还提供了本专利技术第一方面所述的mRNA或本专利技术第二方面所述的mRNA
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TS在制备降低肝移植后受体病原菌感染的药物中的应用。
[0015]进一步地，所述病原菌包括但不限于MRSA、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等。
[0016]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果：
[0017]1)在肝脏移植手术前，给供体肝脏外源的高表达PANX1，会降低肝移植术后的细菌的感染，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染，提高患者的生存率。
[0018]2)为了提高PANX1对下游通路的激活作用，本专利技术在其C
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端添加额外的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的位点序列LVEPLTPSGEAPNQALLR，并将其命名为PANX1
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TS。经过试验发现，相对Native对照组而言，mRNA、mRNA
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TS灌注组的小鼠生存时间明显延长，各个器官菌载量较少，肝功能等其它器官损伤程度明显减轻。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0020]图1是本专利技术PANX1的mRNA质粒结构图谱；
[0021]图2是本专利技术PANX1
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TS的mRNA质粒结构图谱；
[0022]图3是本专利技术通过像供体肝脏灌输mRNA
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PANX1进行高表达PANX1，然后将高表达PANX1的肝脏移植到受体小鼠中，在进行MRSA感染或者其它病原菌的感染，观察小鼠的存活率。
具体实施方式
[0023]根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
[0024]实施例1
[0025]1、基因片段合成
[0026]从NCBI上查询PANX1蛋白，然后根据人密码子进行相应优化，获得优化后的PANX1蛋白mRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0027]并在上下游加入与pUC57互补配对的长15bp的序列，最后通过合成直接获得DNA序
列。
[0028]2、重组质粒pUC57
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PANX1的制备方法如下，
[0029]pUC57载体用SacI和HindIII双酶切，酶切体系20μL：pUC57载体＜1μg，HindIII 1μL，SacI 1μL，10
×
CutSmart Buffer 2μL，ddH2O将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μL CIP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物通过DNA纯化柱子纯化后，以30μL Elution Buffer洗脱。
[0030]分别取PANX1基因片段与双酶切载体pUC57载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码蛋白PANX1的mRNA，其特征在于，所述mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码蛋白PANX1变体PANX1
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TS的mRNA
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TS，其特征在于，所述mRNA
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TS的序列如SEQ ID NO.2所示。3.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有权利要求1所述的mRNA或含有权利要求2所述的mRNA
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TS，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。4.工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞中含有权利要求3所述的重组表达载体。5.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，蒋望，钟林，阙伟涛，王普森，
申请(专利权)人：蒋望，
类型：发明
国别省市：