一株马立克病病毒特超强毒株及其基因缺失毒株的构建和应用制造技术

本发明专利技术提供了一株马立克病病毒MDV特超强毒株HN302及其基因编辑缺失毒株的构建和应用。本发明专利技术HN302毒株于2021年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21929。本发明专利技术提供的MDV毒株HN302是从国内疫苗免疫鸡群爆发马立克病MD临床病例鸡群中分离得到的，可代表当前国内优势流行毒株。通过病毒分离培养、基因克隆测序、遗传进化分析、间接免疫荧光实验、SPF鸡攻毒致病性分析以及MDV致病型鉴定等，将HN302毒株定义为MDV特超强毒株。该毒株的病毒基因组序列SEQ ID NO.1全长175700bp。本发明专利技术是国内第一个致病型鉴定依据最充分的MDV特超强毒株，可作为亲本毒株用于MD新型高效基因工程疫苗、多联多价疫苗和传代致弱疫苗的研发、创制和应用。创制和应用。创制和应用。

【技术实现步骤摘要】
一株马立克病病毒特超强毒株及其基因缺失毒株的构建和应用


[0001]本专利技术涉及一株马立克病病毒特超强毒株及其基因缺失毒株的构建和应用，属于动物病毒学领域。

技术介绍

[0002]马立克病病毒(Marek
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s disease virus，MDV)属于甲亚科疱疹病毒，基因组全长约170
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180kb。MDV共有3种血清型：血清I型(MDV
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1)、血清II型(MDV
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2)和血清III型(MDV
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3，即HVT)，其中只有MDV
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1具有致病性，早期感染雏鸡可引起法氏囊及胸腺萎缩、外周和中枢神经组织损伤而引起严重的免疫抑制、翅腿神经麻痹以及内脏组织多器官的T细胞淋巴瘤，最终导致鸡群大批死亡，对养禽业危害极其严重，每年导致全球直接经济损失10
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20亿美元。不同MDV
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1流行毒株的致病性强弱差别较大，根据毒力的不同可分为弱毒MDV(Mild MDV,mMDV)、强毒MDV(Virulent MDV,vMDV)、超强毒MDV(Very virulent MDV,vvMDV)以及特超强毒MDV(Very virulent plus MDV,vv+MDV)。
[0003]MDV感染宿主诱发的肿瘤可以用病毒疫苗进行有效的免疫预防，这是世界上第一个可用病毒疫苗成功预防肿瘤和癌症发生的案例。当前，我国用于MD免疫预防的疫苗毒株，主要有MDV
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1疫苗株CVI988/Rispens、814和HVT代表株FC
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126，更早一些时期也曾广泛使用过MDV
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2的SB
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1株，这些疫苗株在MD的有效防控中发挥了重要作用。虽然疫苗的广泛应用可以较好地预防MD肿瘤的发生，但由于持续的免疫压力和病毒的自身进化，近年来MDV的毒力不断增强，部分毒株已经突破了现有MD商品疫苗的免疫保护，vv+MDV及部分变异株的出现及潜在的流行，已经导致疫苗免疫鸡群中仍不断有MD的爆发和流行，给世界和我国的养禽业造成了严重经济损失。
[0004]根据过去近50年间针对MDV毒力进化规律的研究发现，MDV每15～20年会有一个大的毒力增强的演化。最近5年，我国疫苗免疫鸡群MD爆发的案例也迅猛增加，这将预示着新一轮的MDV毒力增强可能正在发生，但当前我国鸡群是否广泛流行vv+MDV尚缺乏充分证据。从我国MD疫苗免疫鸡群发病的临床病例鸡中分离鉴定具有自主知识产权、毒力更强的MDV毒株，可为现有疫苗免疫效力评估及新一代MD高效疫苗的研发和创制提供重要的依据和材料。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一株马立克病病毒特超强毒株及其基因缺失毒株的构建和应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]一株马立克病病毒特超强毒株，所述马立克病病毒特超强毒株为马立克病病毒HN302，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21929。
[0008]所述马立克病病毒株HN302的病毒全基因组核苷酸序列全长为175700bp，如SEQ ID NO.1所示。
[0009]所述马立克病病毒株HN302为马立克病病毒特超强毒株vv+MDV。
[0010]所述的马立克病病毒特超强毒株HN302构建的MDV基因缺失毒株。
[0011]所述MDV基因缺失毒株是以马立克病病毒株HN302为亲本毒株，构建的MDV单基因或多基因缺失疫苗候选毒株。
[0012]构建MDV基因缺失毒株的方法，包括但不仅限于利用CRISPR/Cas9基因编辑技术、细菌人工染色体BAC技术或基因同源重组技术；所述缺失基因包括但不仅限于MDV蛋白编码基因或非编码RNA基因。
[0013]所述缺失基因包括但不仅限于meq基因缺失、miR
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M11基因缺失或LAT
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miRs基因缺失。
[0014]所述的马立克病病毒特超强毒株HN302在MDV疫苗研发和创制中的应用。
[0015]所述的MDV基因缺失毒株在MDV疫苗研发和创制中的应用。
[0016]所述MDV疫苗为鸡马立克病MD基因工程疫苗、鸡马立克病MD多联疫苗、鸡马立克病MD多价疫苗或鸡马立克病MD传代致弱疫苗；所述鸡马立克病MD基因工程疫苗为基因缺失、基因重组或载体疫苗；所述应用包括但不仅限于利用所述马立克病病毒特超强毒株的病毒粒子、病毒核酸DNA或全基因组序列信息。
[0017]本专利技术有益效果：
[0018]1、本专利技术分离鉴定的MDV特超强毒株HN302，是从河南省漯河市某养禽场MD疫苗免疫后爆发疫情的蛋鸡群中分离得到的，可很好的代表当前国内鸡群流行的MDV优势毒株，毒株来源和背景清晰。本专利技术证实该毒株可突破第一代MD疫苗HVT和第三代疫苗CVI988的免疫保护，为揭示国内免疫鸡群仍爆发MD的免疫失败成因提供了重要科学依据。
[0019]2、本专利技术通过一系列研究和实验，将HN302定义为MDV特超强毒株，是国内第一个提供最全面可靠实验依据的特超强毒株，包括从病毒分离培养、meq基因测序、遗传进化分析、血清型IFA鉴定、病毒全基因组测序分析，尤其是基于1日龄SPF鸡攻毒实验的动物致病性分析和基于MD疫苗免疫攻毒保护指数评价的MDV致病型鉴定实验，填补了我国自主知识产权MDV特超强毒株的空白。
[0020]3、本专利技术提供的MDV特超强毒株HN302及其全基因组序列，可作为亲本毒株利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术，构建一系列的MDV单基因或多基因缺失疫苗候选毒株，如meq基因缺失的HN302Δmeq、miR
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M11基因缺失的HN302ΔM11、LAT
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miRs基因缺失的HN302ΔLAT等单基因缺失候选毒株，以及双基因缺失候选毒株HN302ΔmeqΔM11和HN302ΔM11ΔLAT。可为新一代MD高效疫苗的创制奠定重要基础，同时也可为其他家禽病毒的基因工程重组疫苗提供载体，还可为现有的MD商品疫苗及后续研发MD疫苗的免疫效果评价提供重要的攻毒种。
附图说明
[0021]图1 MDV
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1细胞培养物和分离株meq基因的PCR鉴定结果。
[0022]其中：A表示CEF细胞培养物的meq基因PCR扩增结果；B，表示病毒单噬斑克隆的meq基因PCR扩增结果；M，表示DNA分子量Marker；图1A中1～7，表示MD临床病例鸡的样品编号；
图1B中1～6，表示纯化的病毒单噬斑克隆号。
[0023]图2 HN302与MDV参考毒株meq基因的系统发生树分析结果。
[0024]图3 HN302毒株的间接免疫荧光实验IFA鉴定结果。
[0025]其中：Plaque，表示普通光照下的MDV病毒噬斑；IFA，表示间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株马立克病病毒特超强毒株，其特征在于，所述马立克病病毒特超强毒株为马立克病病毒HN302，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21929。2.如权利要求1所述的马立克病病毒特超强毒株，其特征在于，所述马立克病病毒HN302的病毒全基因组核苷酸序列全长为175700bp，如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的马立克病病毒特超强毒株，其特征在于，所述马立克病病毒HN302为马立克病病毒特超强毒株vv+MDV。4.利用权利要求1所述的马立克病病毒特超强毒株HN302构建的MDV基因缺失毒株。5.如权利要求4所述的MDV基因缺失毒株，其特征在于，所述MDV基因缺失毒株是以马立克病病毒HN302为亲本毒株，构建的MDV单基因或多基因缺失疫苗候选毒株。6.如权利要求4所述的MDV基因缺失毒株，其特征在于，构建MDV基因缺失毒株的方法，包括但不仅限于利用CRISPR/...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊，滕蔓，郑鹿平，张改平，王伟东，刘金玲，赵东，程娜，柴书军，邢广旭，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：