一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括病毒释放、病毒澄清、病毒灭活、宿主DNA降解、病毒浓缩和病毒纯化这几个步骤，其中，病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，病毒澄清步骤采用连续流离心，病毒纯化步骤采用连续流蔗糖密度梯度离心；所述制备方法在病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，与冻融破碎相比，压力破碎步骤简单且可以连续进样，大大缩短操作时间，与超声波破碎相比，压力破碎不易破坏病毒活性且对宿主细胞的破碎效果更好，大大提高病毒收获液的质量，另外，压力破碎能够实现闭环化无菌操作且破碎条件稳定，更有助于实现规模化工业生产。于实现规模化工业生产。于实现规模化工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，属于生物医药


技术介绍

[0002]轮状病毒（Rotavirus，RV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科，是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一，全球每年感染人数上亿，造成死亡人数数十万。在我国，每年大约有1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。
[0003]安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。目前，通常使用轮状病毒灭活疫苗控制轮状病毒感染。但是，历史上多次发生因疫苗纯度不够影响疫苗的产品质量，导致疫苗在临床使用后产生较大副作用的事件。这促使食品和药物管理局（FDA）、欧洲药品评估机构（EMEA）对降低过敏和自身免疫反应等能副作用水平的安全要求不断增加，对疫苗的纯度、无菌性和安全性等提出了更高的要求。疫苗企业也需要不断努力改进疫苗生产过程中的下游工艺，以对疫苗进行更加严格的精细化生产，进而适应国际上对疫苗的高要求。
[0004]轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺主要包括病毒收获后的病毒释放、病毒澄清、宿主DNA降解、病毒灭活、病毒浓缩以及病毒纯化这几个步骤。现阶段，轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺主要存在以下缺陷：第一，病毒释放步骤常采用反复冻融破碎或超声破碎，其中，反复冻融破碎法冻结和融化均需要较长时间，操作周期长；超声破碎法产生的热量大，容易破环病毒活性，且超声波探头面积需要与处理量成正比，大规模生产过程中等比放大工艺较难实现；第二，病毒纯化步骤主要使用阴离子交换层析，该工艺需要将病毒澄清液高倍浓缩，浓缩过程剪切力会对病毒结构造成破坏，降低回收率，并且，该工艺的层析效果受杂质、压力、盐浓度等因素影响，层析柱的分离效果效会随着使用次数增加而快速降低，同时，层析柱需要在使用若干次以后重新装填，受操作人员经验和技术等因素影响，每次装柱并不能保证层析柱完全一致，另外，层析液含高浓度盐离子，需要使用透析袋或脱盐柱进行脱盐，在大规模生产过程中，会增加成本，降低回收率。
[0005]亟需找到可克服上述缺陷的轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺，以对疫苗进行更加严格的精细化生产，进而适应国际上对疫苗的高要求。

技术实现思路

[0006]为解决现有轮状病毒灭活疫苗的制备方法存在的问题，本专利技术提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；病毒灭活：将病毒澄清液进行灭活，得到病毒灭活液；宿主DNA降解：在病毒灭活液中添加核酸酶和氯化镁对病毒灭活液中的宿主DNA进
行降解，得到病毒降解液；病毒浓缩：将病毒降解液进行浓缩，得到病毒浓缩液；病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；或者，所述制备方法包括如下步骤：病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；宿主DNA降解：在病毒澄清液中添加核酸酶和氯化镁对病毒澄清液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；病毒灭活：将病毒降解液进行灭活，得到病毒灭活液；病毒浓缩：将病毒灭活液进行浓缩，得到病毒浓缩液；病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；所述细胞破碎采用压力破碎；所述纯化采用连续流蔗糖密度梯度离心。所述压力破碎是指细胞悬液在破碎仪柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的细胞液以极高的流速（1000~1500米/秒）喷出，碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。所述连续流蔗糖密度梯度离心是指用一定浓度蔗糖溶液与PBS溶液在离心力的作用下，在离心机转子内形成连续的蔗糖密度梯度，病毒浓缩液从转子底端进入从转子顶端流出，此流经过程中，分子量不同的病毒颗粒与杂质蛋白因沉降系数不同而停留到不同浓度的蔗糖区间内，从而达到纯化效果。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述压力破碎的条件为：破碎压力10~60bar、进液流速50~300mL/min。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述压力破碎的条件为：破碎压力10bar、进液流速100mL/min。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述澄清采用连续流离心；所述连续流离心的条件为：固定离心力8000~12000g、上样速度600~800mL/min、温度2~8℃。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述连续流离心的条件为：固定离心力10000g、上样速度700mL/min、温度4℃。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β
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丙内酯和病毒澄清液混合后，于2~8℃下孵育48~72h；或者，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β
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丙内酯和病毒降解液混合后，于2~8℃下孵育48~72h。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述灭活为：按照体积比1：1000将β
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丙内酯和病毒澄清液混合后，于4℃下孵育60h；或者，所述灭活为：按照体积比1：1000将β
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丙内酯和病毒降解液混合后，于4℃下孵育60h。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为5~100U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为5~100U/mL。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为30U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为30U/mL。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为0.5~10mM；
或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为0.5~10mM。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为2mM；或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为2mM。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述降解的条件为：温度20~45℃、时间2~6h。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述降解的条件为：温度37℃、时间3h。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述浓缩为：将病毒降解液浓缩至原体积的1/10。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述浓缩为：采用截留分子量100~300KD的超滤系统将病毒降解液浓缩至原体积的1/4~1/6后，加入pH 7.0~7.4、浓度0.005~0.1M的缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/4~1/6，重复此操作4~7次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；病毒灭活：将病毒澄清液进行灭活，得到病毒灭活液；宿主DNA降解：在病毒灭活液中添加核酸酶和氯化镁对病毒灭活液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；病毒浓缩：将病毒降解液进行浓缩，得到病毒浓缩液；病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；或者，所述制备方法包括如下步骤：病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；宿主DNA降解：在病毒澄清液中添加核酸酶和氯化镁对病毒澄清液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；病毒灭活：将病毒降解液进行灭活，得到病毒灭活液；病毒浓缩：将病毒灭活液进行浓缩，得到病毒浓缩液；病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；所述破碎采用压力破碎；所述压力破碎的条件为：破碎压力10~60bar、进液流速50~300mL/min；所述纯化采用连续流蔗糖密度梯度离心；所述连续流蔗糖密度梯度离心的条件为：初始蔗糖溶液浓度50~80g/100mL、固定离心力20000~40000g、上样速度90~150mL/min、温度4~15℃。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述澄清采用连续流离心；所述连续流离心的条件为：固定离心力8000~12000g、上样速度600~800mL/min、温度2~8℃。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β
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丙内酯和病毒澄清液混合后，于2~8℃下孵育48~72h；或者，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β
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丙内酯和病毒降解液混合后，于2~8℃下孵育48~72h。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为5~100U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为5~100U/mL。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为0.5~10mM；或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为0.5~10mM。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述降解的条件为：温度20~45℃、时间2~6h。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩为：采用截留分子量100~300KD的超滤系统将病毒降解液浓缩至原体积的1/4~1/6后，加入pH 7.0~7.4、浓度0.005~0.1M的缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/4~1/6，重复此操作4~7次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液、MPB缓冲液或
Tris
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HCl缓冲液。10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述轮状病毒的病毒培养液的制备方法包括如下步骤：宿主细胞制备：将Vero细胞用细胞生长液配置成细胞密度为1.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：安祺，田大勇，张雅春，赵玉瑛，
申请(专利权)人：北京赛尔富森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：