一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体GVA-P21及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体GVA

A bacteriophage gva-p21 of Vibrio alginolyticus with high fermentation rate and long-lasting bacteriostasis and its application

【技术实现步骤摘要】
一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21及其应用


[0001]本专利技术属于微生物技术应用领域，特别涉及一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21及其应用。

技术介绍

[0002]随着海水养殖产业的迅速发展和集约化养殖规模的不断扩大，海水养殖业中细菌性疾病的发病率越来越高。在导致水产养殖动物感染的病原菌中，致病性弧菌占有较高的例，这不仅给水产动物健康带来高风险，也给海水养殖产业造成严重的经济损失。
[0003]常见的水产动物致病性弧菌主要有鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌，其中，溶藻弧菌的数量居海洋弧菌之首，其引起的弧菌病具有发病率高、死亡率高、流行范围广等特点。溶藻弧菌可引起人的伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病，又可引起鱼、虾、贝等海水养殖动物的弧菌病爆发，尤其是夏季，溶藻弧菌病的爆发常造成水产养殖业巨大的经济损失。目前针对水产养殖相关的弧菌病主要采用抗生素治疗为主，但是，随着抗生素的滥用，越来越多的病原弧菌产生耐药性，使得病原菌的耐药性问题愈发严重。
[0004]噬菌体是指感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，其结构简单，特异性强，能高效裂解宿主病原菌；溶藻弧菌噬菌体能有效裂解溶藻弧菌，在水产养殖预防和治疗上具有非常巨大的优势和潜力。
[0005]本专利技术通过筛选得到的溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21，通过研究其生物学特性，为溶藻弧菌的生物控制提供新的方法。

技术实现思路
/>[0006]本专利技术的目的之一是提供一株溶藻弧菌噬菌体(Vibrio alginolyticus phage)；
[0007]本专利技术的目的之二是将所述的溶藻弧菌噬菌体(Vibrio alginolyticus phage)应用于抑菌。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
[0009]申请人在广东湛江某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21，所述噬菌体在2021年11月23日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 20211480，命名为GVA
‑
P21。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0011]本专利技术所述溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝0.01时，发酵6h，效价可达8.24
×
10
10
PFU/mL，对工业发酵提供了理论数据。
[0012]本专利技术所述溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21具有较宽裂解谱，对355株溶藻弧菌中的339株具有裂解效果，裂解率达95.5％，对溶藻弧菌的预防与治疗提供了优异的治疗资源与方法。
[0013]本专利技术所述溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21具有优秀的抑菌表现，抑菌时长可达24h，与其它噬菌体相比，具有明显、直观的抑菌效果，在24h时，噬菌体GVA
‑
P21将溶藻弧菌OD
600
控
制在0.20以内，噬菌体VAPL1组的溶藻弧菌OD
600
到达1.1，浓度相差5倍。
[0014]本专利技术能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源和安全、无毒副作用、特异性强且可大规模发酵生产的生物防控措施。
附图说明
[0015]图1为本专利技术溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21噬菌斑；
[0016]图2为本专利技术溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21电镜图；
[0017]图3为本专利技术不同感染复数下溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21的效价；
[0018]图4为本专利技术反应不同时间后溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21的pH值稳定性；
[0019]图5为溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21于不同温度下存放不同时间后的效价；
[0020]图6为溶藻弧菌噬菌体GVA
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P21的工业发酵动态；
[0021]图7为溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21与VAPL1溶藻弧菌的动态抑菌结果。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0023]实施例1：
[0024]溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21的分离纯化
[0025]在广东湛江某水产养殖水塘采集水样3份，每份50mL，6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，取5mL处理后上清液与0.5mL溶藻弧菌(浓度为5
×
108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，放置于28℃培养箱中150rpm/min振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，得种子滤液，取滤液100μL与300μL溶藻弧菌(浓度为5
×
108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，将混合物与2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培养皿噬菌体的效价，在培养皿上挑取噬菌斑透而亮的斑点，于1mLSM液中振荡解吸附后过0.22um的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL2％氯化钠TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主溶藻弧菌菌液并混匀，静止吸附15min，37℃下150rpm/min过夜培养，5000rpm/min离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3
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5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
[0026]从水样中分离到两株溶藻弧菌噬菌体，分别是GVA
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P21与VAPL1。噬菌体GVA
‑
P21与宿主菌形成圆形透亮的噬菌斑，直径为1mm。该噬菌体GVA
‑
P21已于2021年11月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，命名为溶藻弧菌噬菌体(Vibrio alginolyticus phage)GVA
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P21，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 20211480。
[0027]实施例2：
[0028]溶藻弧菌噬菌体GVA
‑
P21对溶藻弧菌裂解范围实验
[0029]采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。准备好足量的盛有3mL的2％氯化钠TSB的EP管，355株溶藻弧菌接种于该培养基中，37℃恒温200rpm/min振荡7h，得到355份溶藻弧菌菌液；准备好足量的TSA底板，将0.9ml溶藻弧菌菌液与50℃左右的6ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分离的溶藻弧菌噬菌体(Vibrio alginolyticus phage)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211480，命名为GVA

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，黄金梅，田甲，张秀玲，徐岳，张晓东，李越，胡雄，
申请(专利权)人：武汉格瑞农生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：