具有肝脏特异靶向性的纯化的腺相关病毒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及纯化的腺相关病毒(AAV)及其用于治疗肝脏疾病或需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病的用途。本发明专利技术的纯化的AAV具有优异的肝脏特异靶向性，以及更低的中和抗体水平，体现了更低的免疫原性和更高的安全性。体现了更低的免疫原性和更高的安全性。体现了更低的免疫原性和更高的安全性。

【技术实现步骤摘要】
具有肝脏特异靶向性的纯化的腺相关病毒及其应用


[0001]本公开涉及具有肝脏特异靶向性的纯化的腺相关病毒(AAV)及其用于治疗肝脏疾病或需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病的用途。

技术介绍

[0002]近年来，腺相关病毒(AAV)载体在基因治疗中的应用引起了极大的关注。然而，野生型AAV血清型(例如AAV2、AAV5、AAV8和AAV9)由于组织特异性不佳，会感染哺乳动物的多个组织/器官。为了改善AAV的器官和组织靶向性，我们已构建了一种血清型突变体AAVz2(图1A和图1B，SEQ ID NO：1，描述于CN 113121652 A)，并利用亲和柱层析加一步碘克沙醇超速离心对其进行纯化，已发现如此纯化得到的AAVz2对视网膜和肌肉具有高亲和性。
[0003]利用AAV载体进行的肝脏靶向基因治疗，已在A型血友病和B型血友病的多项临床试验中取得了令人瞩目的成功(参考文献1)。在这些情况下，中等剂量的AAV给药足以安全地恢复血液凝固。然而，将AAV更广泛地应用于其他疾病可能需要更高效的肝细胞基因递送能力和更少的组织/器官脱靶转导。因此，开发具有优异肝细胞靶向性的AAV血清型是一个有前景的方向。
[0004]此外，针对AAV病毒的预先存在的中和抗体(Nab)也是其应用在更广泛的人群中的最大障碍之一。循环中的Nab能够屏蔽暴露在衣壳蛋白表面的受体结合位点并阻断AAV进入靶细胞或通过免疫系统加速AAV的耗竭，使AAV载体的治疗效果无效。尽管已有报道在原代人类肝细胞和人类肝细胞的异种移植小鼠模型中，工程化AAV病毒已经改善了肝脏转导，但预先存在的Nab显著降低了这些AAV血清型的活性(参考文献2)。
[0005]参考文献：
[0006]1.Leebeek FWG,Miesbach W.Gene therapy for hemophilia:A review on clinical benefit,limitations,and remaining issues.Blood.2021；138:923
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931
[0007]2.Perocheau DP,Cunningham S,Lee J,Antinao Diaz J,Waddington SN,Gilmour K,Eaglestone S,Lisowski L,Thrasher AJ,Alexander IE,Gissen P,Baruteau J.Age
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related seroprevalence of antibodies against aav
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lk03 in a uk population cohort.Human gene therapy.2019；30:79
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87

技术实现思路

[0008]专利技术人出乎意料地发现，通过特定的纯化方法(即两步的碘克沙醇密度梯度超速离心)，可以改善AAVz2(SEQ ID NO：1)的肝脏靶向性。
[0009]因此，在第一方面，本公开提供一种纯化的腺相关病毒(AAV)，其中，所述AAV通过两步的碘克沙醇密度梯度超速离心纯化获得，所述AAV为AAVz2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]在一个实施方式中，碘克沙醇密度梯度包括：15w/v％、25w/v％、40w/v％、60w/v％的碘克沙醇。
[0011]在一个实施方式中，AAV的纯化不包括亲和柱层析步骤。
[0012]在一个实施方式中，AAV是真核细胞或原核细胞包装生产的AAV。
[0013]在一个实施方式中，AAV是三质粒转染法或昆虫杆状病毒法包装生产的AAV。
[0014]与用亲和柱层析加一步的碘克沙醇超速离心的纯化方法获得的AAV相比，本公开的纯化的AAV具有改善的肝脏靶向性。
[0015]在第二方面，本公开提供一种纯化腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：通过两步的碘克沙醇密度梯度超速离心纯化AAV。
[0016]在一个实施方式中，AAV是AAVz2。
[0017]在一个实施方式中，本公开的方法包括：(i)将含有AAV的溶液装载至碘克沙醇密度梯度上方，进行超速离心，得到一次纯化液；以及(ii)将步骤(i)的一次纯化液装载至碘克沙醇密度梯度上方，进行超速离心，得到纯化的AAV。
[0018]在一个实施方式中，本公开的方法不包括亲和柱层析步骤。
[0019]本公开的纯化方法提高了AAV在体内和体外对于肝脏细胞的转导效率，但对于其他组织器官的转导效率并无明显提高，使得肝脏转导特异性显著改善。
[0020]通过本公开的上述纯化方法纯化得到的AAV载体具有优异的肝脏特异靶向性，以及更低的中和抗体水平，体现了更低的免疫原性和更高的安全性。具有优异的肝脏特异靶向性的本公开的AAV载体可应用于肝脏相关疾病或需要递送药物至肝脏的其他疾病的预防和治疗，且低脱靶(非靶器官)效应和低免疫原性增强了其安全性潜力。
[0021]在第三方面，本公开提供根据第一方面所述的AAV在制备用于治疗疾病的药物中的应用，其中，所述疾病为肝脏疾病或需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病。
[0022]在第四方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第一方面所述的AAV和赋形剂。
[0023]在一个实施方式中，赋形剂包括盐、有机物和/或表面活性剂。
[0024]在一个实施方式中，药物用于肝脏疾病或需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病的预防、诊断和治疗。
[0025]在一个实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，优选静脉内施用、口服施用、鼻腔内施用、翘内施用、肌肉内施用、皮下施用、腹膜内施用或病灶内施用；优选通过全身途径或局部途径施用于肝脏。
[0026]在一个实施方式中，肝脏疾病包括：原发或继发性肝癌、肝硬化、肝脓肿、脂肪肝、酒精性肝病、肝移植、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝炎、药物毒性肝炎以及其他肝炎。
[0027]在一个实施方式中，需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病包括：A型和B型血友病、溶酶体贮积症(例如MPS II和III)、法布里综合征(Fabry
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s disease)、糖原贮积症、贝墩氏症(Batten disease)、高歇氏病(Gaucher
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s disease)、沃尔曼氏症(Wolman
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s disease)、威尔逊氏症(Wilson
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s disease)、自身免疫性疾病(例如多发性硬化症、重症肌无力、风湿或类风湿性关节炎、红斑狼疮、自身免疫性心脏病)、心血管疾病或肺部疾病(例如高血压、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、慢性阻塞性肺疾病)、高血氨症、糖尿病、沙费利波综合征、综合性创伤、肾衰竭、贫血。
[0028]在第五方面，本公开提供一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第四方面所述的药物，所述受试者患有肝脏疾病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化的腺相关病毒(AAV)，其中，所述AAV通过两步的碘克沙醇密度梯度超速离心纯化获得，所述AAV为AAVz2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的AAV，其中，所述碘克沙醇密度梯度包括：15w/v％、25w/v％、40w/v％、60w/v％的碘克沙醇。3.根据权利要求1或2所述的AAV，其中，所述AAV是真核细胞或原核细胞包装生产的AAV。4.根据权利要求1或2所述的AAV，其中，所述AAV的纯化不包括亲和柱层析步骤。5.权利要求1至4中任一项所述的AAV在制备用于治疗疾病的药物中的应用，其中，所述疾病为肝脏疾病或需要递送基因至肝脏中表达的其他疾病。6.根据权利要求5所述的应用，其中，肝脏疾病包括：原发或继发性肝癌、肝硬化、肝脓肿、脂肪肝、酒精性肝病、肝移植、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝炎、药物毒性肝炎以及其他肝炎。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵锴，陈晨，刘强，章一品，袁龙辉，郑静，肖啸，杜增民，蒋威，吴博，刘素丽，
申请(专利权)人：上海勉亦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：