【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长V(D)J信息
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2019年11月8日提交的美国临时专利申请序列第62/933285号的权益，为了所有目的此相关申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]领域
[0005]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，并且特别涉及使用分子条形码化的多组学分析。
[0006]对相关技术的描述
[0007]分子条形码化的方法和技术可用于单细胞转录组学分析，包括使用例如逆转录、聚合酶链式反应(PCR)扩增和下一代测序(NGS)破译基因表达谱以确定细胞的状态。分子条形码化还可用于单细胞蛋白质组学分析。需要对核酸靶(例如，含V(D)J的转录物)进行全长表达谱分析的方法和技术。需要能够对核酸靶(例如，含V(D)J的转录物)进行鉴定和计数两者的组合物和方法。
[0008]概述
[0009]本文的公开内容包括用于对样品中的核酸靶进行标记的方法。在一些实施方案中，方法包括：使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记(例如，第一分子标记)和能够与核酸靶杂交的靶结合区；产生各自包含靶结合区和靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子；使每种条形码化的核酸分子的靶结合区的互补体与以下中的一种或更多种的靶结合区杂交：(i)多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)条形码化的核酸分子自身，以及(iii)多于...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对样品中的核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子；使每种条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与以下中的一种或更多种的靶结合区杂交：(i)所述多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)所述条形码化的核酸分子自身，以及(iii)所述多于一种条形码化的核酸分子中的不同的条形码化的核酸分子；延伸所述多于一种条形码化的核酸分子的3
’
末端以产生各自包含第一分子标记和第二分子标记的多于一种延伸的条形码化的核酸分子；使用能够与所述核酸靶的序列杂交的靶特异性引物和包含所述第一通用序列的引物扩增所述多于一种延伸的条形码化的核酸分子，由此产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第一多于一种条形码化的扩增子；使随机引物与所述第一多于一种条形码化的扩增子杂交并延伸所述随机引物以产生多于一种延伸产物，其中所述随机引物包含第二通用序列或其互补体；以及使用能够与所述第一通用序列或其互补体和所述第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第二多于一种条形码化的扩增子。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：基于与所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或它们的组合的数量来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。3.一种用于确定样品中核酸靶的数量的方法，所述方法包括：使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子；使每种条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与以下中的一种或更多种的靶结合区杂交：(i)所述多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)所述条形码化的核酸分子自身，以及(iii)所述多于一种条形码化的核酸分子中的不同的条形码化的核酸分子；延伸所述多于一种条形码化的核酸分子的3
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末端以产生各自包含第一分子标记和第二分子标记的多于一种延伸的条形码化的核酸分子；使用能够与所述核酸靶的序列杂交的靶特异性引物和包含所述第一通用序列的引物扩增所述多于一种延伸的条形码化的核酸分子，由此产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第一多于一种条形码化的扩增子；使随机引物与所述第一多于一种条形码化的扩增子杂交并延伸所述随机引物以产生多于一种延伸产物，其中所述随机引物包含第二通用序列或其互补体；
使用能够与所述第一通用序列或其互补体和所述第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第二多于一种条形码化的扩增子；以及基于与所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或它们的组合的数量来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。4.根据权利要求2
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3中任一项所述的方法，其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括：(a)基于与所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物关联的具有不同序列的第二分子标记的数量来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数，和/或(b)基于与所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数量来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，所述方法包括在使每种条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与以下的靶结合区杂交之前使所述多于一种条形码化的核酸分子变性：(i)所述多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)所述条形码化的核酸分子自身，和/或(iii)所述多于一种条形码化的核酸分子中的不同条形码化的核酸分子。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，所述方法包括在扩增所述多于一种延伸的条形码化的核酸分子之前使所述多于一种延伸的条形码化的核酸分子变性。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化的核酸分子中的所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中在延伸所述多于一种条形码化的核酸分子的3
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末端之后，使所述第一分子标记与所述第二分子标记杂交。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述延伸的条形码化的核酸分子各自包含所述第一分子标记、所述第二分子标记、所述靶结合区和所述靶结合区的互补体。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述靶结合区的互补体与所述靶结合区的一部分互补。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含基因特异性序列、多(dT)序列或两者。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子包括：(i)使用所述多于一种寡核苷酸条形码对样品中的核酸靶的拷贝进行条形码化，以产生各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列、第一分子标记和所述靶结合区的多于一种条形码化的核酸分子；以及(ii)使包含所述靶结合区的互补体的寡核苷酸附接到所述多于一种条形码化的核酸分子以产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子。14.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中产生各自包含所述靶结合区和所述
靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子包括：(i)使用所述多于一种寡核苷酸条形码对样品中的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列、第一分子标记和所述靶结合区的多于一种条形码化的核酸分子；(ii)扩增所述多于一种条形码化的核酸分子以产生多于一种扩增的条形码化的核酸分子；以及(iii)使包含所述靶结合区的互补体的寡核苷酸附接到多于一种扩增的条形码化的核酸分子以产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子。15.根据权利要求13
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14中任一项所述的方法，其中对样品中的核酸靶的拷贝进行条形码化包括延伸与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码以产生所述多于一种条形码化的核酸分子。16.根据权利要求15所述的方法，其中延伸与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码包括对与所述多于一种寡核苷酸条形码杂交的所述核酸靶的拷贝进行逆转录。17.根据权利要求13
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16中任一项所述的方法，其中附接包含所述靶结合区的互补体的所述寡核苷酸包括将包含所述靶结合区的互补体的所述寡核苷酸连接到所述多于一种条形码化的核酸分子和/或扩增的条形码化的核酸分子。18.根据权利要求13
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16中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含多(dT)序列，并且其中附接包含所述靶结合区的互补体的所述寡核苷酸包括使用末端脱氧核苷酸转移酶将多于一种腺苷单磷酸添加到所述多于一种条形码化的核酸分子和/或扩增的条形码化的核酸分子。19.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子包括：在存在逆转录酶和包含所述靶结合区或其部分的模板转换寡核苷酸的情况下，延伸与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码，以产生各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列、第一分子标记、所述靶结合区和所述靶结合区的互补体的多于一种条形码化的核酸分子。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述逆转录酶能够具有末端转移酶活性。21.根据权利要求19
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20中任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸包含一个或更多个3
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核糖核苷酸，并且任选地三个3
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核糖核苷酸。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述3
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核糖核苷酸包括鸟嘌呤。23.根据权利要求19
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22中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中使条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与所述条形码化的核酸分子自身的所述靶结合区杂交包括使条形码化的核酸分子内的所述靶结合区和所述靶结合区的互补体进行分子内杂交以形成茎环。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二分子标记是所述第一分子标记的互补体。
26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中使条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与所述多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的所述靶结合区杂交包括使条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与所述多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的所述靶结合区进行分子间杂交。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二分子标记不同于所述第一分子标记，并且其中所述第二分子标记不是所述第一分子标记的互补体。28.根据权利要求26
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27中任一项所述的方法，所述方法包括延伸与所述条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体杂交的所述寡核苷酸条形码的3
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末端以产生各自包含所述第一分子标记的互补体和第二分子标记的多于一种延伸的条形码化的核酸分子。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二分子标记的序列不同于所述第一分子标记的序列，并且其中所述第二分子标记不是所述第一分子标记的互补体。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中使条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与所述多于一种条形码化的核酸分子中的不同条形码化的核酸分子的所述靶结合区杂交包括使条形码化的核酸分子的所述靶结合区的互补体与所述多于一种条形码化的核酸分子中的不同条形码化的核酸分子的所述靶结合区进行分子间杂交。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二分子标记的序列不同于所述第一分子标记的序列，并且其中所述第二分子标记不是所述第一分子标记的互补体。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，其中所述样品包括单细胞、多于一个细胞、多于一个单细胞、组织、肿瘤样品或它们的任何组合。33.根据权利要求32所述的方法，其中单细胞包括免疫细胞或循环肿瘤细胞，任选地所述免疫细胞是B细胞或T细胞。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中所述靶特异性引物与免疫受体特异性杂交，任选地所述靶特异性引物与免疫受体的恒定区、免疫受体的可变区、免疫受体的多样性区、免疫受体的可变区和多样性区的连接区或它们的组合特异性杂交。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫受体是T细胞受体(TCR)和/或B细胞受体(BCR)；任选地所述TCR包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链或它们的任何组合；并且还任选地所述BCR受体包含BCR重链和/或BCR轻链。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中延伸所述多于一种条形码化的核酸分子的3
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末端包括使用缺乏5
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至3
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核酸外切酶活性和3
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至5
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核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶延伸所述多于一种条形码化的核酸分子的3
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末端，并且任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段。37.根据权利要求1
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36中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物的序列信息，并且任选地获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，其中扩增所述多于一种延伸产物包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述多于一种延伸产物；任选地所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列或其一部分；并且还任选地所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列或其一部分。39.根据权利要求37
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38中任一项所述的方法，其中获得所述第二多于一种条形码化的
扩增子或其产物的序列信息包括：获得包含所述第二多于一种条形码化的扩增子或其产物的多于一个测序读段的测序数据，其中所述多于一个测序读段中的每一个包含(1)细胞标记序列，(2)分子标记序列，和/或(3)所述核酸靶的子序列。40.根据权利要求39所述的方法，所述方法包括：对于指示所述样品中的单细胞的每个独特细胞标记序列：使所述核酸靶的所述多于一个测序读段中的每一个对齐以产生所述核酸靶的对齐序列。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述核酸靶的对齐序列包含所述核酸靶的cDNA序列的至少50％、所述核酸靶的cDNA序...
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