超声法核酸探针制备方法技术

本发明专利技术提供一种超声法核酸探针制备方法，所述制备方法中带有氨基活性基团核酸与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在30

【技术实现步骤摘要】
超声法核酸探针制备方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种超声法核酸探针制备方法。

技术介绍

[0002]单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。而对DNA或者RNA的结构进行一些改造，就形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。DNA修饰探针与RNA修饰探针广泛应用在分子诊断QPCR（实时荧光定量）、STR（短串联重复序列）、以及FISH（荧光原位杂交技术）等领域。
[0003]一般地，有两种常见的方法可用于单链DNA与RNA的改造。一种为固相亚磷酰胺三酯法，另一种为液相氨基活化酯加成法。传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性基团的DNA或RNA溶解在碱性的缓冲液中，然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的活化酯修饰染料，在常温反应4
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12小时，然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，拿到沉淀固体，然后用水溶解，最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的DNA修饰探针或RNA 修饰探针。
[0004]液相氨基活化酯加成法，需要在DNA或者RNA上合成氨基结构（NH2），同时需要活化酯修饰染料为琥珀酰亚胺活化酯结构，见下反应式（1），这种活化酯结构，相比较亚磷酰胺结构，容易合成。
[0005]液相氨基活化酯加成法的具体操作的方案如下：（1）将100nmol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于100ul pH为8.5的0.5MNa2CO3/NaHCO
3 缓冲液中，充分震荡混匀。
[0006]（2）用37.5ulDMF溶剂去溶解300nmol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，室温震荡混匀。
[0007]（3）将上述溶液放入摇床，震荡4
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12小时。
[0008]（4）在上述溶液中加入2mL酒精，
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20℃冷冻30分钟出现絮状沉淀，12000转高速离心，去除上清液，取沉淀。
[0009]（5）用2ml
ꢀ‑
20℃冷冻酒精清洗沉淀3遍，并将沉淀烘干，得DNA/RNA修饰探针粗品。
[0010]（6）用1mL超纯水将干燥后的DNA/RNA修饰探针粗品溶解，装载至高效液相色谱仪
上纯化，拿到纯的产品。
[0011]液相氨基活化酯加成法具有以下不足：（1）因为DNA/RNA都易溶于水，而琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体绝大多数都是不溶于水的，所以琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体都需要有机溶剂进行溶解。且为了反应体系偏向于均相反应，需要使用与水互溶性较高的有机溶剂，而这些有机溶剂都具有较高的毒性。
[0012]（2）因反应过程使用了有机溶剂以及缓冲盐，这些都必须在后续生产中提前去除，故在反应后处理中，会大量使用乙醇进行沉淀洗涤后处理。产生较多的有机溶剂浪费。
[0013]（3）琥珀酰亚胺活化酯修饰染料与DNA/RNA底物的摩尔比例约为3:1，但是因为反应为含水的反应，虽然琥珀酰亚胺活化酯修饰染料能优先与带有氨基结构的DNA/RNA反应，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料也能与水较快发生副反应，液相氨基活化酯加成法的最终摩尔收率仍然不高，大多数都在20
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30%之间，即以修饰染料利用率来看，仅为7
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10%。材料成本仍然太高。
[0014]（4）因DNA/RNA的内部结构复杂包裹，当DNA含有50个以上脱氧核苷酸、RNA含有40个以上核苷酸时，其带有的氨基结构难以与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料接触反应，传统的液相氨基活化酯加成法收率极低。
[0015]固相亚磷酰胺三酯法的合成过程主要有脱保护、偶联、盖帽、氧化4个步骤。每完成4个步骤就连接上一个脱氧核苷酸或核苷酸，通过重复这4个步骤，就把一个个的脱氧核苷酸或核苷酸连接起来就形成了DNA或RNA。
[0016]利用固相亚磷酰胺三酯法也可以在合成DNA/RNA过程中，把修饰染料合成到DNA或RNA的链上。
[0017]固相亚磷酰胺三酯法（1）固相亚磷酰胺三酯法为固液两相反应，所需要的修饰染料与DNA/RNA底物的比例为20:1以上，其摩尔收率约为30
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40%，即以修饰染料利用率来看，仅为1.5
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2%，材料成本
dye SE seris,(Alexa 染料系列)、AMCA
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X SE、ATTO dye SE seris. (ATTO 染料系列)。
[0036]本专利技术的液相氨基活化酯超声加成法是一种快速高效的合成DNA/RNA修饰探针的方法。本专利技术通过将带有氨基活性基团的单链核酸溶解在碱性缓冲液中然后加入1
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4倍摩尔量的有机溶剂溶解的修饰染料活化酯，放在超声仪中在30
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50℃温度加热超声5
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15分钟，利用超声波产生的空化作用促进反应加速完成；然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，拿到沉淀固体，加入超纯水并利用超声快速溶解，即可直接装载至高效液相色谱仪上进行纯化，并得到纯的DNA修饰探针或RNA 修饰探针。本专利技术在生产过程中不需要等待4
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12小时的反应，只需5min即可反应完成，极大的提高了反应速率，极大的缩短了反应周期；同时本专利技术大大提高了修饰染料的利用率，特别是对于长链核酸，例如46个碱基以上的核酸。
[0037]更为重要的是，本专利技术解决了固相亚磷酰胺三酯法的应用受限问题，解决了传统的液相氨基活化酯加成法对于结构复杂的DNA/RNA修饰探针生产困难的问题。
具体实施方式
[0038]为了使本领域
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0039]实施例一本专利技术方法的基本原理通过超声波产生空化现象，使带有氨基结构的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料快速结合，提高了化学反应速率；同时因为反应时间极短，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不会降解，副反应大大减少，从而可以保证反应充分进行。本专利技术的反应化学方程式如下：具体的实施方案如下：步骤一：将200nmol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于200ul pH为8.5的0.5M Na2CO3/NaHCO3缓冲液中，充分震荡混匀；步骤二：用75ulDMF溶剂去溶解600nmol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，将此溶液加入至步骤一缓冲液中，震荡混匀；步骤三：将溶液放入超声仪，45度加热超声5
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10分钟；步骤四：在上述溶液中加入酒精沉淀，12000转高速离心，去除上清液，取沉淀；
步骤五：用酒精清洗沉淀3遍，并将沉淀烘干，得DNA/RNA修饰探针粗品；步骤六：用超纯水将干燥后的DNA/RNA修饰探针粗品溶解，装载至高效液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超声法核酸探针制备方法，其特征在于，所述制备方法中带有氨基活性基团核酸与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在30
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50℃碱性缓冲溶液中超声反应制备得到核酸探针，所述超声反应的频率为35~50KHZ。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中带有氨基活性基团核酸与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在45℃碱性缓冲溶液中超声反应制备得到核酸探针。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为DNA或/和RNA，所述活化酯修饰染料是琥珀酰亚胺活化酯或异硫氰酸活化酯修饰染料。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声反应的时间为5
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15分钟。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声反应的时间为5
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10分钟。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声反应的频率为40KHZ。7.根据权利要求1所述的制备方法，所述带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛云龙，苏敏，蔡晶晶，李俊，
申请(专利权)人：上海百力格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：