一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术涉及一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，在细菌悬浮液中添加了无机盐LiCl和NH4Ac，使细菌裂解液中RNA容易沉淀去掉，使得提取溶液的保存时间长，需要的经费少；在细菌裂解液中提高葡萄糖浓度和质粒复性液中添加了高浓度的异硫氰酸胍，能够防止质粒的降解，保证了提取的质粒完整。同时本发明专利技术采用了硅胶膜技术，收集溶液中的质粒所需时间短，减少了质粒与溶液的接触时间，不仅可以提取小质粒，也可以提取大的质粒，能够满足分子生物学实验的测序和酶切等操作。等操作。等操作。

【技术实现步骤摘要】
一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]质粒是细菌中的一种独立于染色体以外的能够自我复制的环状DNA分子，可以用于基因的保存和复制、酶切、重组载体的构建和转化等研究。质粒的质量与分子生物学研究进程密切相关，质量好的质粒有利于分子生物学研究的顺利进行。
[0003]提取大肠杆菌中的质粒一般都包括裂解细菌、变性蛋白质和核酸、复性质粒和除去杂质、沉淀质粒等步骤。由于传统的SDS碱裂解法(J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南[M].科学出版社，2008年)提取质粒时，溶液I葡萄糖的浓度低也没有加入Rnase酶、溶液III中没有加蛋白抑制剂，并且需要苯酚氯仿抽提来去除蛋白质，提取所需的时间长，提取到的质粒少，可能降解了，也含有大量的细菌RNA，不能用于测序和酶切等操作。目前市场中的各种质粒提取试剂盒，由于运用了硅胶膜技术或者磁珠技术，提取质粒的耗时短，但是需要使用Rnase和溶菌酶等生物制剂容易失效，保存的时间短，所以对于一些实验人员少和资金不足的实验室来说会造成试剂的浪费和资金的损失。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，通过改进细菌悬浮液和质粒复性液的组成和浓度，减少了质粒提取的时间，使得提取得到的质粒更加完整，消除了蛋白质和细菌基因组DNA和RNA的污染。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，所述试剂盒包括细菌悬浮液和质粒复性液；
[0007]所述细菌悬浮液的组成成分包括：50
‑
120mmol/L葡萄糖、10
‑
30mmol/L EDTA、20
‑
30mmol/L Tris
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HCl、1.5
‑
3.0mol/L LiCl、0.5
‑
1.5mol/L NH4Ac；所述质粒复性液的组成成分包括：0.8
‑
3mol/L KAc和3.5
‑
4.5mol/L异硫氰酸胍。
[0008]优选的，所述试剂盒还包括细菌裂解液，所述细菌裂解液的组成成分包括0.2mol/L NaOH和1％SDS。
[0009]优选的，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液的组成成分包括70％
‑
80％乙醇水溶液。
[0010]本专利技术还提供了利用上述试剂盒提取细菌质粒的方法，所述方法包括如下步骤：
[0011]利用细菌悬浮液悬浮细菌后加入细菌裂解液进行变性裂解，然后加入质粒复性液进行质粒复性，离心，所得上清液转入硅胶柱中，经洗涤液洗涤，即得所述质粒。
[0012]优选的，所述细菌悬浮液与细菌的体积比为(150
‑
370)μL：(1
‑
5)mL。
[0013]优选的，所述细菌裂解液与细菌的体积比为(250
‑
370)μL：(1
‑
5)mL，所述变性裂解的时间为4
‑
5min。
[0014]优选的，所述质粒复性液与细菌的体积比为(320
‑
520)μL：(1
‑
5)mL，所述质粒复性的时间为1
‑
3min。
[0015]优选的，所述洗涤液与细菌的体积比为(500
‑
650)μL：(1
‑
5)mL，所述洗涤的次数为2
‑
3次。
[0016]优选的，洗涤后的硅胶柱利用35
‑
50μL 60℃双蒸水洗脱即得所述质粒。
[0017]优选的，所述细菌包括大肠杆菌DH5α、TOP10、JM109或农杆菌EHA105，GV3101。
[0018]本专利技术提供了一种改良的碱裂解法提取细菌质粒的方法，由于使用了传统碱裂解法中使用的NaOH来裂解细菌，使用SDS来除去蛋白质，使得细菌裂解彻底和除去蛋白的效果好；在细菌悬浮液中添加了无机盐LiCl和NH4Ac，使细菌裂解液中RNA容易沉淀去掉，去除细菌RNA的效果好，使得提取溶液的保存时间长，需要的经费少；而且在质粒复性液中添加了高浓度的异硫氰酸胍，能够变性DNA酶，防止了质粒的降解，保证了提取的质粒完整。同时本专利技术采用了硅胶膜技术，收集溶液中的质粒所需时间短，减少了质粒与溶液的接触时间。因此采用本专利技术所述试剂盒和方法提取的质粒完整、无蛋白质和细菌基因组DNA和RNA的污染，不仅可以提取4kb左右的小质粒，也可以提取13kb左右的大的质粒，能够满足分子生物学实验的测序和酶切等操作。
附图说明
[0019]图1为改良的碱裂解法提取大肠杆菌质粒电泳图，其中，A为实施例1提取结果，B为实施例2提取结果，C为实施例3提取结果，D为对比例1提取结果，E为对比例2提取结果，F为对比例3提取结果，G为对比例4提取结果，H为对比例5提取结果，a为pBI121
‑
EGFP质粒，b为pGM
‑
T载体与目的基因构建的重组质粒，c为细菌RNA，1代表对含有pGM
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T载体与目的基因构建的重组质粒的DH5α培养液的提取结果，2代表对含有pBI121
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EGFP质粒的DH5α培养液的提取结果。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，所述试剂盒包括细菌悬浮液和质粒复性液；
[0021]所述细菌悬浮液的组成成分包括：50
‑
120mmol/L葡萄糖、10
‑
30mmol/L EDTA、20
‑
30mmol/L Tris
‑
HCl、1.5
‑
3.0mol/L LiCl、0.5
‑
1.5mol/L NH4Ac；所述质粒复性液的组成成分包括：0.8
‑
3mol/L KAc和3.5
‑
4.5mol/L异硫氰酸胍。
[0022]本专利技术中，所述细菌悬浮液的组成成分优选包括：80
‑
110mmol/L葡萄糖、15
‑
25mmol/L EDTA、22
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28mmol/L Tris
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HCl、2.0
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2.8mol/L LiCl、0.8
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1.3mol/L NH4Ac，更优选包括：100mmol/L葡萄糖、20mmol/L EDTA、25mmol/L Tris
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HCl、2.5mol/L LiCl、1.0mol/L NH4Ac。本专利技术中，所述细菌悬浮液的pH优选为8.0。本专利技术中，所述质粒复性液的组成成分优选包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细菌悬浮液和质粒复性液；所述细菌悬浮液的组成成分包括：50
‑
120mmol/L葡萄糖、10
‑
30mmol/L EDTA、20
‑
30mmol/L Tris
‑
HCl、1.5
‑
3.0mol/L LiCl、0.5
‑
1.5mol/L NH4Ac；所述质粒复性液的组成成分包括：0.8
‑
3mol/LKAc和3.5
‑
4.5mol/L异硫氰酸胍。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细菌裂解液，所述细菌裂解液的组成成分包括0.2mol/L NaOH和1％SDS。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液的组成成分包括70％
‑
80％乙醇水溶液。4.一种利用权利要求1～3的试剂盒提取细菌质粒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用细菌悬浮液悬浮细菌后加入细菌裂解液进行变性裂解，然后加入质粒复性液进行质粒复性，离心，所得上清液转入硅胶柱中，经洗涤液洗涤，即得所述质...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国文，
申请(专利权)人：湖南科技学院，
类型：发明
国别省市：