导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码系统的信号肽超高速筛选方法技术方案

本发明专利技术涉及如下的组合物，即，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到细胞外的最佳信号肽。并且，本发明专利技术涉及如下的筛选方法，即，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到细胞外的特定信号肽。若利用本发明专利技术的组合物和/或筛选方法，则可通过为每个上述信号肽制备的条形码序列超高速筛选最适合靶蛋白的信号肽，因此，可最大化重组蛋白的生产收率。的生产收率。的生产收率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码系统的信号肽超高速筛选方法


[0001]本专利技术涉及包含条形码序列的组合物，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽。

技术介绍

[0002]随着全世界生物科学技术的发展，对于蛋白质的结构及功能的研究一直积极进行，随着重组药物市场的爆发式增长，包括对于疾病靶点具有特异性、副作用小的治疗用抗体在内，以往以小分子药物为主的全球制药市场的版权正被颠覆。
[0003]重组蛋白药物是指针对难以利用基因重组技术从活体获得的治疗用蛋白成分，通过微生物或动物细胞系统大量生产的药物。可调节重组蛋白在细胞中表达或分泌到细胞外。当在细胞中表达时，因蛋白质的过表达而在细胞中经常聚集成非活性状态的不溶性块，即便并非如此，也提供诸多降低生产性的因素，例如，破碎细胞的不便及与存在于细胞中的诸多蛋白质进行分离的纯化工序上的困难等。相反，若将生成的蛋白质分泌到细胞外，则可轻易避免随上述情况而发生的困难。并且，由于蛋白质的细胞外分泌只有在蛋白质在转录后被正确折叠及修饰时才可能发生，因此，具有如下优点，即，当生产治疗用蛋白质时，可获得具有精确三级结构的活化形态的可溶性蛋白质。因此，以能够分泌到细胞外的方式生产重组蛋白有利于蛋白质的生产收率及蛋白质的质量管理(quality control)。因此，在制备重组蛋白药物的过程中，需要能够将重组蛋白有效分泌到细胞外的最佳步骤。
[0004]信号肽位于分泌蛋白或膜蛋白的N末端，作为起到分泌蛋白或膜蛋白的靶向(targeting)信号作用的氨基酸序列，当前已知的真核生物信号肽种类多样，有4000种～5000多种。在生产靶蛋白的过程中，靶蛋白的细胞外分泌率可能因应用的信号肽而异，与此相关的报告有通过筛选适合靶蛋白的信号肽来优化靶蛋白细胞外分泌的研究(Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)(2011)43(2)：96
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102，Signal peptide replacements enhance expression and secretion of hepatitis C virus envelope glycoproteins.Biochem Biophys Res Commun.2010Jan 1；391(1)：931
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5，Signal peptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirus expression vector system.)。
[0005]因此，当开发蛋白质药物时，在上述4000种以上的信号肽中，若超高速筛选最适合靶蛋白表达的信号肽并将其导入靶蛋白中，则可以人为地诱导重组蛋白药物产量的最大化。
[0006]以上，作为
技术介绍
来说明的事项仅用于增进对本专利技术背景的理解，不应被视为承认这些事项对应于本专利技术
的本
的普通技术人员已知的现有技术。

技术实现思路

[0007]技术问题
[0008]本专利技术人致力于寻找一种可以超高速搜索能够将靶蛋白高效分泌到细胞外且最适合靶蛋白分泌的信号肽的方法。结果确认到，若通过组合特定种类的氨基酸来为每个上述信号肽制备条形码序列并将其文库化后，在宿主细胞中表达并利用宿主细胞的培养液对靶蛋白进行定量，则可筛选出能够将靶蛋白有效分泌到外的最佳信号肽，从而完成了本专利技术。
[0009]因此，本专利技术的目的在于，提供如下的组合物，即，用于在各种信号肽(signal peptide)中筛选将靶蛋白(target protein)有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽(signal peptide)。
[0010]本专利技术的再一目的在于，提供筛选方法，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到细胞外的特定信号肽。
[0011]本专利技术的其他目的及优点可通过以下本专利技术的具体说明、专利技术要求保护范围及附图变得进一步明确。
[0012]解决问题的方案
[0013]根据本专利技术的一方面，本专利技术提供如下的组合物，即，用于在各种信号肽(signal peptide)中筛选将靶蛋白(target protein)有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽(signal peptide)。
[0014]本专利技术人致力于寻找一种可以超高速搜索能够将靶蛋白高效分泌到细胞外且最适合靶蛋白分泌的最佳信号肽的方法，结果发现，若通过组合特定种类的氨基酸来为每个上述信号肽制备条形码序列并将其应用于靶蛋白，则可筛选出能够将靶蛋白有效分泌到外部的最佳信号肽。
[0015]在本说明书中，术语“信号肽”或“signal peptide”是指与分泌到细胞外的分泌性蛋白的N末端(前端)结合而通过细胞膜的肽。通常，上述信号肽由10个至30个氨基酸组成，在通过膜的过程中，被特异蛋白酶(protease)切割并去除，只允许上述分泌蛋白分泌到细胞外。据目前所知的存在于真核细胞中的信号肽共有4137种(Uniprot，2017.06)。
[0016]分泌到细胞外的分泌性蛋白分别具有固有信号肽，但预计分别具有不同的信号肽，以表达细胞种类、表达蛋白质的作用或表达适量的蛋白质。
[0017]在本说明书中，术语“靶蛋白”或“target protein”是指利用适当的宿主细胞高效生产的蛋白质，在开发生物药物时，若将对靶蛋白的最佳信号肽导入重组蛋白，则可以人为地诱导上述靶蛋白产量的最大化。
[0018]根据本专利技术的优选实例，上述组合物包含含有信号肽标签(SP
‑
tag，Signal peptide tag)的多肽或编码上述多肽的核酸分子。
[0019]在本说明书中，术语“信号肽标签”、“Signal peptide tag”或“SP
‑
tag”作为包含由每个信号肽的条形码互不相同的3个以上的氨基酸组成的条形码序列(Barcoding sequence)的标签，是指可直接或通过连接肽结合在靶蛋白的C末端(后端)的肽标签。
[0020]根据本专利技术的优选实例，上述3个以上的氨基酸选自由亮氨酸(L，Leucine)、脯氨酸(P，Proline)、丙氨酸(A，Alanine)、色氨酸(W，Tryptophan)、酪氨酸(Y，Tyrosine)、苏氨酸(T，Threonine)、丝氨酸(S，Serine)、谷氨酸(E，Glutamate)及天冬氨酸(D，Aspartate)组成的组中。
[0021]在组合上述9种氨基酸中的3个来生成密码子的情况下，总共可以对729种(9
×9×
9)信号肽进行条形码化，在组合4个来生成密码子的情况下，可对6561种(9
×9×9×
9)信号肽进行条形码化，在组合5个来生成密码子的情况下，可对59049种(9
×9×9×9×
9)信号肽进行条形码化。考虑到当前已知真核生物的信号肽种类为4137种，上述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽，其特征在于，上述组合物包含含有信号肽标签的多肽或编码上述多肽的核酸分子，上述信号肽标签包含由每个信号肽的条形码互不相同的3个以上的氨基酸组成的条形码序列，上述3个以上的氨基酸选自由亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸及天冬氨酸组成的组中。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述信号肽标签还包含蛋白质水解切割位点，上述蛋白质水解切割位点位于上述条形码序列的N末端，使得条形码序列能够被蛋白质切割。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点选自由胰蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点、因子Xa切割位点、胶原酶切割位点及烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点组成的组中。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点为胰蛋白酶切割位点。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，上述胰蛋白酶切割位点选自由赖氨酸及精氨酸组成的组中。6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点通过连接肽与条形码序列相连接。7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，上述连接肽包含一个以上的甘氨酸。8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含上述信号肽标签的多肽在上述条形码序列的C末端还包含亲和标签，上述亲和标签用于在宿主细胞培养液中分离及纯化条形码序列。9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，上述亲和标签选自由His标签、myc标签、FLAG标签、SUMO标签、CYD标签、HPC标签、CBP标签及HA标签组成的组中。10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，上述亲和标签为由2个至15个组氨酸组成的His标签。11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述信号肽标签由以下式1表示：式1：胰蛋白酶切割位点
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连接肽
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条形码序列
‑
连接肽
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亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：金圣燮，崔昭瑛，朴智勋，陈钟华，张明熙，
申请(专利权)人：金圣燮，
类型：发明
国别省市：