一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmIsa2、ZmIsa3、ZmZpu1基因同时进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因突变片段的突变体材料，这些玉米籽粒类胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。

A method of improving carotenoid content in corn kernel by using gene editing technology

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素是一类具有独特结构和功能的重要天然色素，在光养和非光养生物中广泛分布，目前已经有超过700种天然类胡萝卜素被鉴定，其化学多样性非常丰富。类胡萝卜素通过化学或酶转化成其他衍生物，如维生素A、植物激素或芳香类化合物等；维生素A缺乏症是全世界主要微量营养素缺乏症之一。研究表明富含类胡萝卜素的饮食(主要由水果和蔬菜组成)具有促进健康作用，同时有助于降低患某些癌症及心血管、眼睛、皮肤或骨骼疾病的风险。由于类胡萝卜素无法通过人体自身合成，而是在食物中与其他分子如糖类、蛋白质或脂肪酸相结合从而被人体摄取，因此研究人体从膳食中摄取及吸收类胡萝卜素的效率及其影响因素至关重要。
[0003]类胡萝卜素还作为饲料添加剂，对动物正常生长、发育具有特殊意义，如常见的“无症状”发热、延期排卵、卵泡囊肿、黄体减少以及胎盘停滞、繁殖发育障碍等症状，添加后均可得到很大程度的改善。另外，产蛋鸡在添加富含类胡萝卜素的饲料后，提高产蛋率的同时蛋黄颜色也会加深，提高其营养价值。本专利技术可以使普通玉米籽粒中类胡萝卜素含量提高2倍，具有重要的饲用价值。
[0004]传统高胡萝卜素玉米材料的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。
[0005]类胡萝卜素是人类发现的第一种天然色素，类胡萝卜素长链分子的主链通常是由9～11个共轭C＝C键构成，其线性链的长度对应于分子铆钉穿透膜的疏水区的厚度，从而在某些真菌与动物体内起到增强细胞膜脂质功能的作用。类胡萝卜素通常根据分子组成分为两类：一类指在多烯主链的一端或两端有碳氢环的非极性类胡萝卜素(如β
‑
胡萝卜素、番茄红素)，另一类是指结构中具有含氧基团
‑
OH(如叶黄素)，＝O(如斑蝥黄素)，OH与＝O的结合(如虾青素)，或醇酯(如岩藻黄素)的极性类胡萝卜素。在生物体所含天然磷脂双分子层膜中，分子两端带有羟基和/或氧基的极性类胡萝卜素如叶黄素，以垂直于磷脂膜表面的长轴方向定位于磷脂的极性头，将导致脂质烷基链的运动自由度降低，模型膜和生物膜中水和氧的通透性降低，这些效应被称为膜中的固化效应；而不含氧的β
‑
胡萝卜素中对称的脂肪链与磷脂的非极性部分发生非共价结合，增加磷脂头极性基团的运动自由度，导致膜结构的流动性增强，因此类胡萝卜素的数量与种类是影响膜功能的重要参数。类胡萝卜素的机械特性在进化后期用于保护蛋白质的相关结构，暴露的类胡萝卜素外部结构能够与蛋白质相互结合，从而对环境条件产生一定抵抗性。
[0006]因此，提供一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，具体步骤如下：
[0010](1)针对基因ZmIsa2设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；
[0011]所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：
[0012]ZmIsa2：5
’‑
GCGGAGATACGGACACACCGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.4；
[0013](2)以pCBC
‑
MT1T2质粒为模板，MT1T2
‑
F，MT1T2
‑
F0为引物，PCR扩增目的片段；
[0014]所述引物序列如下：
[0015]MT1T2
‑
F：5
’‑
AATAATGGTCTCAGGCGCCTTTGATGAACTGACGCA
‑3’
；SEQ ID NO.5；
[0016]MT1T2
‑
F0：5
’‑
GCCTTTGATGAACTGACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；SEQ ID NO.6；
[0017](3)针对基因ZmIsa3、ZmZpu1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；
[0018]所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：
[0019]ZmIsa3：5
’‑
ACCACGACGAAAGTTCAGAGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.7；和
[0020]ZmZpu1：5
’‑
TGGTCAGACTGAGAACAGCGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.8；
[0021](4)以pCBC
‑
MT1T2质粒为模板，MT1T2
‑
F
’
，MT1T2
‑
F0
’
，MT1T2
‑
R0
’
，MT1T2
‑
R
’
为引物，PCR扩增目的片段；
[0022]所述引物序列如下：
[0023]MT1T2
‑
F
’
：5
’‑
AATAATGGTCTCAGGCGCCACGACGAAAGTTCAGAG
‑3’
；SEQ ID NO.9；
[0024]MT1T2
‑
F0
’
：5
’‑
GCCACGACGAAAGTTCAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；SEQ ID NO.10；
[0025]MT1T2
‑
R0
’
：5
’‑
CGCTGTTCTCAGTCTGACCCGCTTCTTGGTGCC
‑3’
；SEQ ID NO.11；
[0026]MT1T2
‑
R
’
：5
’‑
ATTATTGGTCTCTAAACCGCTGTTCTCAGTCTGACC
‑3’
；SEQ ID NO.12；
[0027](5)将步骤(2)和步骤(4)获得的目的片段分别与载体pBUE411进行酶切连接，分别构建得到ZmIsa2基因编辑载体pBUE411
‑
1gR
‑
ZmIsa2和ZmIsa3、ZmZpu1基因编辑载体pBUE411
‑
2gR
‑
ZmIsa3
‑
ZmZpu1；
[0028](6)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)针对基因ZmIsa2设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：ZmIsa2：5
’‑
GCGGAGATACGGACACACCGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.4；(2)以pCBC
‑
MT1T2质粒为模板，MT1T2
‑
F，MT1T2
‑
F0为引物，PCR扩增目的片段；所述引物序列如下：MT1T2
‑
F：5
’‑
AATAATGGTCTCAGGCGCCTTTGATGAACTGACGCA
‑3’
；SEQ ID NO.5；MT1T2
‑
F0：5
’‑
GCCTTTGATGAACTGACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；SEQ ID NO.6；(3)针对基因ZmIsa3、ZmZpu1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：ZmIsa3：5
’‑
ACCACGACGAAAGTTCAGAGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.7；和ZmZpu1：5
’‑
TGGTCAGACTGAGAACAGCGCGG
‑3’
；SEQ ID NO.8；(4)以pCBC
‑
MT1T2质粒为模板，MT1T2
‑
F
’
，MT1T2
‑
F0
’
，MT1T2
‑
R0
’
，MT1T2
‑
R
’
为引物，PCR扩增目的片段；所述引物序列如下：MT1T2
‑
F
’
：5
’‑
AATAATGGTCTCAGGCGCCACGACGAAAGTTCAGAG
‑3’
；SEQ ID NO.9；MT1T2
‑
F0
’
：5
’‑
GCCACGACGAAAGTTCAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；SEQ ID NO.10；MT1T2
‑
R0
’
：5
’‑
CGCTGTTCTCAGTCTGACCCGCTTCTTGGTGCC
‑3’
；SEQ ID NO.11；MT1T2
‑
R
’
：5
’‑
AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋广树，吕庆雪，周迎鑫，孙蕾，周德龙，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：