一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。本发明专利技术分别在RpHsfC1和RpHsfC1

【技术实现步骤摘要】
一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。

技术介绍

[0002]杜鹃是我国的著名花卉，又作为我国的传统十大名花，杜鹃花的地理分布非常广泛，杜鹃可以在从低海拔到高海拔的不同植被地带生长，但杜鹃花主要分布在海拔1500～4000m的地区，喜冷凉的环境。目前随着全球气候变暖的加剧，高温已经成为全球性的自然灾害，涉及范围较广，然而温度是影响植物生长发育的重要因素，不适宜的生长温度极易影响植物的生长代谢。目前栽培的大多数杜鹃优良品种的耐热性较差，当温度超过35℃时，植物会进入半休眠状态，新梢和新叶的生长也会变得缓慢。目前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，因此对杜鹃耐热相关基因的发掘为今后杜鹃的分子遗传育种具有重要理论和实践意义。热激转录因子(Hsfs)是调控编码热激蛋白(Hsps)的热激(HS)响应基因的核心调控因子，Hsps是一类最为重要的热胁迫蛋白，是植物细胞免受高温伤害的物质基础。目前关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究还大多集中在拟南芥、番茄、甜椒和黄瓜等植物中，在杜鹃还尚未广泛开展此类研究。

技术实现思路

[0003]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，目的是为了解决前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，以及杜鹃还尚未广泛开展关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究的技术问题。
[0004]本专利技术提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，具体技术方案如下：
[0005]一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，构建含有用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体，转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液，将所述侵染菌液侵染的杜鹃，对所述耐热基因的功能进行鉴定分析，所述用于沉默耐热基因特异性片段为用于沉默RpHsfC
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1 like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段，所述用于沉默RpHsfC
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1 like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]在某些实施方式中，包括如下步骤；
[0007]S1，提取杜鹃叶片RNA，反转录获得杜鹃cDNA；
[0008]S2，利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC
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1 like基因特异性片段，利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC
‑
1基因特异性片段；
[0009]S3，将步骤S2中的用于沉默RpHsfC
‑
1 like基因特异性片段、用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接，获得重组载体pTRV2
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HsfC
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1 like、pTRV2
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HsfC
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1；
[0010]S4，将步骤S3中重组载体pTRV2
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HsfC
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1 like、pTRV2
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HsfC
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1以及pTRV1分别转化到农杆菌GV3101 感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体pTRV2
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HsfC
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1 like的菌液、含重组载体pTRV2
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HsfC
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1的菌液以及含pTRV1的菌液；
[0011]S5，将步骤S4的含重组载体pTRV2
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HsfC
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1 like的菌液、含重组载体pTRV2
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HsfC
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1的菌液分别与含 pTRV1的菌液离心收集菌体，并用侵染重悬液重悬至特定OD值后分别与pTRV1的菌液以体积比1：1混匀，即为侵染夜，将所述侵染液侵染杜鹃叶片；
[0012]S6，侵染10天后，采用PCR和RT
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PCR(实时荧光定量)的方法筛选侵染成功的植株，将侵染成功的杜鹃进行正常培养7天，后模拟自然高温条件进行高温胁迫处理，检测HsfC
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1 like、HsfC
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1对在杜鹃的耐性响应中的功能，以及在杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用。
[0013]在某些实施方式中，在步骤S2中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0014]在某些实施方式中，在步骤S2中，所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，所述引物4的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
[0015]在某些实施方式中，在步骤S4中，浸染方式如下：用无菌注射器在杜鹃叶片背部进行注射接种含重组载体pTRV2
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HsfC
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1 like的菌液、含重组载体pTRV2
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HsfC
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1的菌液。
[0016]在某些实施方式中，在步骤S5中，所述高温胁迫处理的温度为40℃/32℃(昼12h/夜12h)。
[0017]在某些实施方式中，在步骤S5中，高温胁迫处理胁迫第5d后选取杜鹃新梢顶叶下的第3
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4层叶片，进行功能验证。
[0018]在某些实施方式中，在步骤S5中，所述耐性响应中的功能分析包括叶绿素荧光参数、叶绿素荧光诱导曲线，所述杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用包括JIP
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test、延迟荧光DF、 820nm反射光谱测定。
[0019]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，具有时间短，速度快，高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化，利用VIGS沉默体系，进行杜鹃耐热性相关基因功能验证。通过荧光定量表达分析，结果发现经过VIGS沉默的目的基因的表达量受到抑制，说明成功沉默了目的基因HsfC
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1 like和HsfC
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1。通过对沉默后植株进行光合荧光特征的分析，发现经过VIGS 沉默掉目的基因HsfC
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1 like和HsfC
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1都对杜鹃叶片产生了影响。本专利技术通过初步鉴定基因的功能，为杜鹃耐热性品种的培育提供了基因来源。
附图说明
[0020]图1是本专利技术提供的一种杜鹃热激转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，构建含有用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体，转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液，将所述侵染菌液侵染的杜鹃，对所述耐热基因的功能进行鉴定分析，所述用于沉默耐热基因特异性片段为用于沉默RpHsfC
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1like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段，所述用于沉默RpHsfC
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1like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤；S1，提取杜鹃叶片RNA，反转录获得杜鹃cDNA；S2，利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC
‑
1like基因特异性片段，利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC
‑
1基因特异性片段；S3，将步骤S2中的用于沉默RpHsfC
‑
1like基因特异性片段、用于沉默RpHsfC
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1基因特异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接，获得重组载体pTRV2
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HsfC
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1like、pTRV2
‑
HsfC
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1；S4，将步骤S3中重组载体pTRV2
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HsfC
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1like、pTRV2
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HsfC
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1以及pTRV1分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体pTRV2
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HsfC
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1like的菌液、含重组载体pTRV2
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HsfC
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1的菌液以及含pTRV1的菌液；S5，将步骤S4的含重组载体pTRV2
‑
HsfC<...

【专利技术属性】
技术研发人员：金松恒，申建双，胡玥，
申请(专利权)人：浙江农林大学暨阳学院，
类型：发明
国别省市：