水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种水稻马铃薯卷叶病毒2（Rice polerovirus 2，RPV2）侵染性克隆载体及其构建方法和应用，在获得RPV2基因组全序列的基础上，通过同源重组的方式将其克隆到含花椰菜花叶病毒双35S启动子的pXT双元载体而获得。本发明专利技术首次制备了能通过农杆菌介导的方法成功接种并稳定高效侵染本生烟、水稻（籼稻和粳稻）植物的侵染性克隆，为研究该病毒基因结构和功能及其与寄主之间的关系奠定基础；使利用正向遗传学方向研究水稻抗病机制，明确水稻中更多潜在的抗病基因成为可能，为培育抗病新品种提供理论和实践依据，最终实现水稻产量和质量的提高。量的提高。

【技术实现步骤摘要】
水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]水稻马铃薯卷叶病毒2（Rice polerovirus 2，RPV2）是由本实验于野生稻发现的马铃薯卷叶病毒属的新病毒，其病毒粒子的形态为正二十面体，基因组为正单链RNA，包含5822个核苷酸，5
’
端与VPg相连，通过多种不同的翻译策略编码7个蛋白。5
’
端ORFs通过基因组依次翻译产生P0、P1和P1
‑
P2蛋白，而3
’
端ORFs则通过亚基因组策略翻译产生P3、P4和P3
‑
P5蛋白，P1
‑
P2与P3之间的区域还存在一个非ATG起始的ORF，编码一个小蛋白P3a。
[0003]该属病毒通常不能通过汁液机械接种，由特异性介体蚜虫以持久循回非增殖的方式专化性传播，且表现出韧皮部局限性。
[0004]侵染性克隆是指将病毒全长基因组序列构建在特定载体上，且具有侵染宿主的功能。根据病毒基因组（DNA或RNA）类型不同，通常分为全长DNA侵染性克隆或全长cDNA侵染性克隆。病毒侵染性克隆的构建为病毒复制、基因功能以及致病机理等的研究提供有利的工具；有利于抗病毒策略和新型病毒载体的设计；有利于作为载体表达外源基因或者沉默内源基因，有利于从正面遗传学系统研究寄主基因功能等。目前，构建策略主要有携带T7、SP6或T3等原核启动子控制的体外转录法侵染性克隆和由花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子控制的体内转录法侵染性克隆两种。其中体内转录法是指把病毒cDNA全基因组置于35S启动子下游，采用合适的方法将构建的质粒DNA接种寄主植物，在真核生物体内，利用35S启动子启动cDNA表达，以达到病毒侵染植物的目的。
[0005]目前已报道的水稻病毒基因组结构较复杂，多为双链和负链形式，少量被发现的正单链水稻病毒相关研究也甚少且不够完整深入。之前有关水稻病毒侵染性克隆的构建仅见水稻黄斑点病毒（Rice yellow mottle virus，RYMV）和水稻东格鲁杆状病毒（Rice tungro bacilli
‑
form virus，RTBV）被报道，并且这两种病毒目前在中国水稻上并未发生，无法利用其进行水稻的相关研究。近期刚报道的水稻条纹叶枯病毒（Rice stipe virus，RSV）侵染性克隆仅在本生烟有侵染性，也无法利用于水稻，故迄今为止仍未有能成功侵染水稻的病毒侵染性克隆的报道。构建野生稻病毒侵染性克隆，预从正向遗传学方向研究水稻抗病机制，以期明确水稻中更多潜在的抗病基因，为培育抗病新品种提供理论和实践依据，最终实现水稻产量和质量的提升。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种水稻马铃薯卷叶病毒2的侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本专利技术构建的水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆不仅能稳定高效侵染模式植物本生烟，还能够侵染水稻。为研究该病毒基因组的结构和功能及其致病机制奠定了基础，并使利用该病毒从正向遗传学方向研究水稻抗病机制，明确水稻中更多潜在的抗病基因成为
可能，为培育抗病新品种提供理论和实践依据。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆，所述侵染性克隆携带有水稻马铃薯卷叶病毒2全基因组RNA对应的全长cDNA序列，所述全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示。
[0008]上述一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的构建方法：将水稻马铃薯卷叶病毒2全基因组RNA对应的全长cDNA序列克隆至带双35S启动子和核酶RZ的载体pXT中制备获得。
[0009]上述一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的构建方法，包括以下具体步骤：(1) 分别以引物对XT001F/RPV2
‑
3267R和引物对RPV2
‑
3248F/XT3R分两段扩增RPV2全长cDNA序列；所述引物XT001F、RPV2
‑
3267R、RPV2
‑
3248F、XT3R的引物序列分别如SEQ ID No.1
‑
4所示；(2) 将纯化的目的片段与经StuI和BamH I线性化的pXT载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，筛选阳性克隆进行测序，进而获得具有RPV2全长cDNA序列的克隆；(3) 提取含RPV2全长cDNA序列克隆的质粒，获得其侵染性克隆载体XT
‑
RPV2。
[0010]所述步骤（2）中pXT载体双酶切的体系为：2.5 μg pXT质粒，10
×
cutsmart buffer，StuI和BamH I各2.5 μL，ddH2O补齐至50 μL。
[0011]所述步骤（2）中重组体系为10 μL： 5
×
CE MultiS Buffer 2 μL，经StuI和BamH I线性化的克隆载体pXT 90 ng，引物XT001F/RPV2
‑
3267R扩增获得的目的片段1和RPV2
‑
3248F/pXT3R获得的目的片段2分别65 ng和50 ng，Exnase MultiS 1 μL，ddH2O调至10 μL。
[0012]一种含有水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的重组菌。进一步的，所述重组菌为含有所述水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的农杆菌。更进一步的，所述农杆菌由pXT
‑
RPV2载体导入农杆菌菌株GV3101获得。
[0013]上述水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆在制备单一病毒侵染植物模型中的应用，所述单一病毒为水稻马铃薯卷叶病毒2。
[0014]上述含有水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用。
[0015]上述水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆或含有水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的重组菌在研究水稻马铃薯卷叶病毒2致病机理中的应用。
[0016]上述水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆或含有水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的重组菌在筛选水稻抗性基因中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果：本专利技术首次制备了能通过农杆菌方法接种并稳定高效侵染本生烟、水稻寄主植物的RPV2侵染性克隆，有利于研究该病毒基因组的结构和功能及其致病机制，对从正向遗传学方向来研究水稻抗病机制，明确水稻中更多潜在的抗病基因具有重要的意义。
附图说明
[0018]图1为侵染性克隆载体pXT
‑
RPV2构建策略。
[0019]图2为RPV2农杆菌接种本生烟的症状及侵染性鉴定。a：浸润本生烟15 dpi症状，EV：浸润空载体pXT，RPV2：浸润RPV2；b：利用Northern blot检测8、14、18、22、30、38 d本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆，其特征在于：所述侵染性克隆携带有水稻马铃薯卷叶病毒2全基因组RNA对应的全长cDNA序列，所述全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示。2.权利要求1所述一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的构建方法，其特征在于：将水稻马铃薯卷叶病毒2全基因组RNA对应的全长cDNA序列克隆至带双35S启动子和核酶RZ的载体pXT中制备获得。3.根据权利要求2所述的一种水稻马铃薯卷叶病毒2侵染性克隆的构建方法，其特征在于：包括以下具体步骤：(1) 分别以引物对pXT001F/RPV2
‑
3267R和引物对RPV2
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3248F/pXT3R分两段扩增RPV2全长cDNA序列；所述引物pXT001F、RPV2
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3267R、RPV2
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3248F、pXT3R的序列分别如SEQ ID No.1
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4所示；(2) 将纯化的目的片段与经Stu I和BamH I线性化的带双35S启动子和核酶RZ的pXT载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，筛选阳性克隆进行测序，进而获得具有RPV2全长cDNA序列的克隆；(3) 提取含RPV2全长cDNA序列克隆的质粒，获得其侵染性克隆载体pXT
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RPV2。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中pXT载体双酶切的体系为：2.5 μg pXT质粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽娟，韩艳红，吴建国，李容柏，赵珊珊，张崇涛，白雅妮，解晓盈，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：