铁皮石斛瞬时转化方法技术

铁皮石斛瞬时转化方法，涉及一种铁皮石斛瞬时转化方法。目的是解决现有铁皮石斛遗传转化周期长导致的铁皮石斛转化方法的转化效率低的问题，方法：培养铁皮石斛原球茎并在高渗透处理液中浸泡，移至加有含重组目的基因的根癌农杆菌的侵染液中侵染，过程中每侵染1.5h后在1.5

Instantaneous transformation method of Dendrobium candidum

【技术实现步骤摘要】
铁皮石斛瞬时转化方法


[0001]本专利技术涉及一种铁皮石斛瞬时转化方法。

技术介绍

[0002]铁皮石斛(Dendrobium officianle)是多年生的附生草本兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)的濒危药用植物，具有益胃生津、滋阴清热之功效，是一种药用范围很广的名贵传统中药，民间誉有“救命仙草”之称。现代药理和化学成分分析表明，铁皮石斛中主要的活性成分是多糖类化合物，具有提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、保肝护胃及抗白内障等作用，其理化及结构特征与药用活性密切相关。同时由于野生铁皮石斛是一种附生植物，生长在疏松度高、透气性强的深厚树皮或树干上，也多见于半阴半阳的悬崖石壁或石缝间，具有优良的抗逆能力，使其成为研究植物多糖合成代谢和抗逆基因克隆的理想材料。但由于铁皮石斛的遗传转化周期较长，转化过程易被内生真菌污染，导致转化效率和成功率极低，通过转基因的方法过表达和RNAi抑制表达目的铁皮石斛基因，用来研究基因的抗逆功能和抗逆机制较难、花费的时间较长、成本较大。寻找一种快速有效的遗传转化方法对铁皮石斛基因功能研究具有重要的意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术是要解决现有铁皮石斛遗传转化周期长导致的铁皮石斛转化方法的转化效率低的问题，提供一种高效快速的铁皮石斛瞬时转化方法。
[0004]本专利技术铁皮石斛瞬时转化方法，按以下步骤进行：
[0005]一、铁皮石斛蒴果表面消毒后，将铁皮石斛蒴果的种子播种于培养基，在室温条件和光照时间为16h/d条件下无菌培养50
‑
60天，得到铁皮石斛原球茎，选取直径为0.2
‑
0.5cm的铁皮石斛原球茎放入高渗透处理液中浸泡10
‑
15min，浸泡期间每隔1
‑
2min晃动一次；另要注意原球茎的状态，如果出现不同程度的萎蔫现象，可适当减少高渗时间，避免原球茎的萎蔫；
[0006]二、将步骤一高渗透处理液处理过的铁皮石斛原球茎转移至加有含重组目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，侵染液需提前配置好并在4℃静置0.5
‑
1.0h；侵染液OD
600
(OD
600
为侵染液在紫外分光光度计600nm波长处的吸光值)为0.9
‑
1.0，然后置于恒温振荡培养箱中，在20～22℃和80～100rpm条件下侵染3～4.5h；侵染3～4.5h过程中每侵染1.5h后转移至可调压力培养箱中并在1.5
×
105Pa下保压10
‑
15min，保压后更换一次新的侵染液后继续侵染；
[0007]步骤二中所述的侵染液为2％(w/v)蔗糖+180mM甘露醇+10mM氯化钙+150μM乙酰丁香酮+10μM激动素+1.5mM维生素C+5μM萘乙酸+1.5mM二硫苏糖醇+0.02％(v/v)Tween20+0.01％(v/v)Triton X
‑
100的1/2MS培养液(pH＝5.8)；需要说明的是，乙酰丁香酮、二硫苏糖醇、Tween20、Triton X
‑
100不可高温灭菌，应过滤灭菌后加入。
[0008]申请人发现适当的施加压力能够加快植物细胞内的新陈代谢，促进植物生长，压
力过大，处理时间过长，对植物生长有阻碍作用，会使细胞受伤害，甚至死亡；而压力过小，处理时间过短，又会造成处理效果不明显。本专利技术即让原球茎处于1.5个大气压中，一方面能让侵染液中的携带重组目的基因的根癌农杆菌更好的附着在原球茎细胞表面，促进重组目的基因进入原球茎细胞内，提高转化效率；另一方面，能够加快已经转化成功了的原球茎细胞的新陈代谢，促进原球茎的生长。
[0009]三、取出步骤二中侵染完成后的原球茎，用中渗透处理液洗涤1
‑
2min。
[0010]采用中渗透处理液洗涤侵染原球茎过程中，侵染液中含有重组目的基因的根癌农杆菌通过细胞膜的吸附作用已经均匀且充分地附着在原球茎的表面，且重组目的基因也已经粘附在农杆菌细胞表面。由于在侵染液中的转化时间较长，且侵染液的渗透压略低于原球茎细胞和农杆菌细胞内的渗透压，因此原球茎细胞会有一定成分的吸涨、膨大，农杆菌细胞也会膨胀成球形；另外，由于侵染液中含有氯化钙，一方面增加了原球茎细胞和农杆菌细胞的膜通透性，另一方面，促使重组目的基因形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物，羟基—钙磷酸是在瞬时转化这个特殊时期，细胞内的DNA酶携带的羟基和侵染液中的氯化钙共同作用下，在根癌农杆菌细胞膜上通过连接作用催化形成的一种特殊的复合物，有利于重组目的基因进入原球茎细胞内。羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面。当侵染结束后，将附着根癌农杆菌的原球茎迅速转移至渗透压相对较高的中渗处理液中，原球茎细胞膜迅速收缩，促使粘附在农杆菌细胞膜表面的重组目的基因进入原球茎细胞内，进而整合到铁皮石斛原球茎的基因组中，提高转化效率。
[0011]四、取出步骤三中洗涤后的原球茎，用无菌滤纸吸干水分，置于含有抗生素的共培养固体培养基，暗培养36～48h，然后转入16h光照和8h黑暗的光周期下、以及室温下继续培养3～5d，即可进行酶活测定或基因表达检测，或者继续培养即可用于转基因植株培育；
[0012]为快速研究铁皮石斛基因功能，建立铁皮石斛原球茎高效瞬时遗传转化体系，也为异源基因在铁皮石斛中的表达和生物学功能研究提供方法学研究基础。本专利技术方法通过选择适宜生理状态的铁皮石斛原球茎(适宜生理状态的原球茎比实生苗幼嫩，且具有全能性，更适于进行转化)、改良的高渗透处理液、侵染液，并结合中渗处理等多因素的共同作用下促使了铁皮石斛瞬时转化效率的大大提高。本专利技术较现有的铁皮石斛稳定转化方法具有操作方便、成本低、周期短、实用性强、效果好等优势。
[0013]植物细胞的全能性，是指植物体上任何一个器官中已分化成熟细胞，具有形成完整植物体的遗传潜力。原球茎是铁皮石斛种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的一种小圆锥形的特殊胚性愈伤组织，是正在生长分化的体细胞胚胎，具有增殖效率高、生长周期短，能够发育成完整铁皮石斛幼苗的特点。本专利技术将铁皮石斛的种子播种于培养基上，经过12
‑
15d的暗培养生成胚性愈伤组织，移至室温和光照时间为16h/d下，继续培养40
‑
50d萌发出原球茎，此时的原球茎还未分化，生长速度最快、代谢能力最旺盛，也最适宜做侵染转化，转化效率高。与实生苗幼嫩相比的好处是实生幼苗即已完成分化，形成根、茎、叶等组织器官，瞬时侵染过程中，重组目的基因在哪个组织进入即在哪个组织中表达，只是局部表达；而原球茎的瞬时侵染过程中，重组目的基因只要进入原球茎的局部，即随着原球茎的分化在整个植株中表达，大大提高转化成功率和效率。
[0014]现有的高渗透处理液为1.0mol/L的甘露醇，此高渗处理液渗透压远高于植物细胞内渗透压。直接将幼嫩的原球茎放入此高渗液中会使植物组织细胞迅速脱水，对原球茎造
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛瞬时转化方法，其特征在于：铁皮石斛瞬时转化方法按以下步骤进行：一、铁皮石斛蒴果表面消毒后，将铁皮石斛蒴果的种子播种于培养基，在室温条件和光照时间为16h/d条件下无菌培养50
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60天，得到铁皮石斛原球茎，选取直径为0.2
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0.5cm的铁皮石斛原球茎放入高渗透处理液中浸泡10
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15min，浸泡期间每隔1
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2min晃动一次；二、将步骤一高渗透处理液处理过的铁皮石斛原球茎转移至加有含重组目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，侵染液需提前配置好并在4℃静置0.5
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1.0h；侵染液OD
600
为0.9
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1.0，然后置于恒温振荡培养箱中，在20～22℃和80～100rpm条件下侵染3～4.5h；侵染3～4.5h过程中每侵染1.5h后转移至可调压力培养箱中并在1.5
×
105Pa下保压10
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15min，保压后更换一次新的侵染液后继续侵染；三、取出步骤二中侵染完成后的原球茎，用中渗透处理液洗涤1
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘羽佳，刘博婷，于白音，韩伟，理雅，罗伟红，赖思慧，陈堰珊，麦阮琳，李学诗，
申请(专利权)人：韶关学院，
类型：发明
国别省市：