一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法技术

一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法，按照植物表达模式，对假单胞菌的多环芳烃降解基因簇及红球菌邻苯二酚降解基因簇进行优化重构，分别构建成不同的植物表达载体，然后通过农杆菌介导共转化到同一植物中。利用本发明专利技术，使微生物源的两组降解基因簇可在植物中进行表达，获得的转基因植物能够将多环芳烃降解产物转变成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，被植物直接吸收利用，种植这种转基因植物能够提高其降解多环芳烃的能力，有利于修复被多环芳烃污染的土壤环境。染的土壤环境。

【技术实现步骤摘要】
一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法


[0001]本专利技术属于植物治理土壤污染领域，具体涉及一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法。

技术介绍

[0002]多环芳烃(PAHs)及其衍生物是一类广泛存在于环境中的有机污染物。PAHs大多通过石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、有机高分子化合物、纸张、作物秸秆、烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成。
[0003]许多PAHs具有显著的急性毒性和潜在的致畸、致癌、致突变作用。多环芳烃化合物由于水溶性差，辛醇
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水分配系数高，常被吸附于土壤颗粒上。因此，该类化合物易于从水中分配到生物体内，沉积层中土壤就成为PAHs的主要载体。多环芳烃在环境中不断积累，其半衰期少则2个月、多则几年。多环芳烃进入土壤后，由土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染。
[0004]利用植物治理土壤多环芳烃污染既节能又对环境相对安全。和微生物修复相比，植物修复更适应原地修复，它具有修复面积大、投资少、不破环场地结构、不引起地下水二次污染等优点，在对重金属和有机污染物的处理中已显示明显的有效性，有的已经达到野外应用的水平。但是，由于植物对多环芳烃的羟化作用较弱，因此，对于多环芳烃的降解能力较低。
[0005]Peng RH等(Metabolic engineering of arabidopsis for remediation of different polycyclic aromatic hydrocarbons using a hybrid bacterial dioxygenase complex.Metabolic Engineering，2014,26：100
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110)先前的研究表明将萘双加氧酶系统转到植物后可以促进植物吸收多环芳烃，提升植物对多环芳烃的修复能力，然而，Henner P等(Phytotoxicity of ancient gaswork soils.Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)on plant germination.Organic Geochemistry，1999,30:275
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284)发现，多环芳烃羟化后产物，以及这些产物在植物中的进一步降解产物均可能产生毒性更强的中间产物，使植物的环境适应能力降低。
[0006]多环芳烃的降解取决于微生物产生加氧酶的能力，多环芳烃的最初氧化，即苯环加氧是控制PAHs生物降解反应速度的关键步骤。萘双加氧酶(naphthalene dioxygenase NDO)系统参与萘的羟基化。萘加氧酶系统含有三个组分：铁硫黄素蛋白还原酶NahAa；铁氧还蛋白NahAb和加氧酶，加氧酶由大亚基NahAc和小亚基NahAd组成四聚体，电子从NAD(P)H通过铁硫黄素蛋白还原酶和铁氧还蛋白向加氧酶传送，促进加氧酶将两个氧原子加到萘的一个苯环上。对很多细菌中的NDO基因结构分析发现，萘加氧酶系统多由上述三个组份构成并且种间具有很高的同源性，说明萘双加氧酶系统普遍存在于自然界。
[0007]在多环芳烃等诱导下，细菌分泌的双加氧酶把氧加到苯环上，形成C
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O键，再经过加氢、脱水等作用使C
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C键断裂，苯环数减少，产生水杨醛，水杨醛在水杨醛脱氢酶催化下产生水杨酸，水杨酸可以通过水杨酸羟化酶催化合成邻苯二酚等小分子化合物，全过程需要
10个基因参与，分别为NahAa，NahAb，NahAc，NahAd，NahB，NahC，NahD，NahE，NahF，和NahG(Peng RH.Microbial biodegradation of polyaromatic hydrocarbons.FEMS Microbiology Reviews，2008,32：927
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955)，然而产生的邻苯二酚对植物具有很强的毒性。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法，通过合成生物学方法，对源于微生物的假单胞菌的多环芳烃降解基因簇及红球菌邻苯二酚降解基因簇进行优化重构，分别构建成不同的植物表达载体，再共转化到同一植物中进行表达，将吸收到植物体内的多环芳烃氧化分解成能够进入三羧酸循环的化合物乙酰辅酶A，直接被植物吸收利用，提高植物对多环芳烃的修复能力。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法，包括以下步骤：
[0011]1)按照植物表达模式，对假单胞菌来源的多环芳烃降解基因簇进行优化重构，构建成包含十价多环芳烃降解基因的由植物启动子控制的多环芳烃降解表达载体，能使多环芳烃降解到邻苯二酚；
[0012]2)按照植物表达模式，对微生物来源的邻苯二酚降解基因簇进行优化重构，构建成包含六价邻苯二酚降解基因的由植物启动子控制的邻苯二酚降解表达载体，能使邻苯二酚降解到乙酰辅酶A；
[0013]3)将多环芳烃降解表达载体和邻苯二酚降解表达载体通过农杆菌介导共转化到同一植物中进行表达。
[0014]进一步，步骤1)及步骤2)中，按照植物偏爱密码、RNA结构稳定性及蛋白翻译效率对多环芳烃降解基因簇和邻苯二酚降解基因簇进行优化重构。
[0015]优选地，步骤1)中，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌，所述多环芳烃为萘。
[0016]又，步骤1)所述多环芳烃降解基因簇来自恶臭假单胞菌的NahAa、NahAb、NahAc、NahAd、NahB、NahC、NahD、NahE、NahF和NahG基因；优化重构后，十价多环芳烃降解基因的具体核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0017]优选地，步骤2)中，所述微生物为假单胞菌或红球菌。
[0018]又，步骤2)中所述邻苯二酚降解基因簇来自红球菌的CatA、CatB、CatCD、CatI、CatJ和CatF基因；优化重构后，六价邻苯二酚降解基因的具体核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
[0019]进一步，步骤3)中，将构建的多环芳烃降解表达载体和邻苯二酚降解表达载体通过电击法导入根癌农杆菌中，所述根癌农杆菌为为EHA105、LBA4404或GV3101。
[0020]又，步骤3)中，所述植物为拟南芥或水稻，转化后利用潮霉素和草胺磷筛选双抗筛选标记植物。
[0021]一种用于植物的完全降解多环芳烃的表达单元，其为由一个按植物表达模式优化后的多环芳烃降解基因、组成型启本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法，包括以下步骤：1)按照植物表达模式，对假单胞菌来源的多环芳烃降解基因簇进行优化重构，构建成包含十价多环芳烃降解基因的由植物启动子控制的多环芳烃降解表达载体，能使多环芳烃降解到邻苯二酚；2)按照植物表达模式，对微生物来源的邻苯二酚降解基因簇进行优化重构，构建成包含六价邻苯二酚降解基因的由植物启动子控制的邻苯二酚降解表达载体，能使邻苯二酚降解到乙酰辅酶A；3)将多环芳烃降解表达载体和邻苯二酚降解表达载体通过农杆菌介导共转化到同一植物中。2.根据权利要求1所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤1)及步骤2)中，按照植物偏爱密码、RNA结构稳定性及蛋白翻译效率对多环芳烃降解基因簇和邻苯二酚降解基因簇进行优化重构。3.根据权利要求1所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤1)中，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌，所述多环芳烃为萘。4.根据权利要求1所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤1)所述多环芳烃降解基因簇来自恶臭假单胞菌的NahAa、NahAb、NahAc、NahAd、NahB、NahC、NahD、NahE、NahF和NahG基因；优化重构后，十价多环芳烃降解基因的具体核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。5.根据权利要求1所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤2)中，所述微生物为假单胞菌或红球菌。6.根据权利要求5所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤2)中所述邻苯二酚降解基因簇来自红球菌的CatA、CatB、CatCD、CatI、CatJ和CatF基因；优化重构后，六价邻苯二酚降解基因的具体核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。7.根据权利要求1所述可完全降解多环芳烃植物的培育方法，其特征在于，步骤3)中，将构建的多环芳烃降解表达载体和邻苯二酚降解表达载体通过电击法导入根癌农杆菌中，所述根癌农杆菌为为EHA105、LBA4404或GV3101。8.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭日荷，姚泉洪，王波，王宇，田永生，王丽娟，严培兰，高建杰，李振军，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：