一种葡萄果梗多酚氧化酶VvPPO1亚细胞定位检测研究方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，包括以下检测步骤：步骤S1、克隆，步骤S2、载体构建，步骤S3、烟草转基因，步骤S4、转基因烟草检测，步骤S5、转基因烟草观察，步骤S1：VvPPO1cDNA全长克隆，步骤S2：植物荧光表达载体的构建，步骤S3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验，步骤S4：转基因烟草植株的获得及其PCR检测，步骤S5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察，所述步骤S2在构建时，将目的片段连接到载体pBI121(携带pENTER/D

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄果梗多酚氧化酶VvPPO1亚细胞定位检测研究方法


[0001]本专利技术涉及葡萄果梗多酚氧化酶
，具体为一种葡萄果梗多酚氧化酶VvPPO1亚细胞定位检测研究方法。

技术介绍

[0002]多酚氧化酶(PPO：EC 1.10.3.1)是一种具有酪氨酸酶/单酚醇化酶和/ 或儿茶酚酶/二酚醇化酶活性的含两个铜原子的酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中。PPOs被称为双铜金属酶，具有两个保守的铜结合域CuA和CuB，负责铜与分子氧和酚基底物的配位和相互作用。以往研究发现植物中的PPO生成位置因品种不同存在显著差异，可不同程度的定位于叶绿体中、质体、类囊体腔和线粒体等细胞器，由细胞核基因编码，在细胞质中合成，然后转移到其他区域，而多酚在液泡中积累。多酚氧化酶(PPO)是一种具有核编码的质体酶，但在融入质体之前是没有活性的。所以PPOs和多酚之间的酶褐变只有在亚细胞分隔因物理损伤或细胞衰老而丧失时才会发生。虽然PPO介导的反应对植物防御系统有重要作用，但由于PPO引起的褐变显著降低了植物产品的贮藏寿命和商业价值。因此，防止PPO介导的褐变反应在鲜果中具有重要意义。事实上，不同来源的多酚氧化酶存在于不同类型的载体中，而同一种载体的不同PPOs由于基因的特异性表达，在不同组织中也起着不同的作用。例如，Suehiro等人发现VvPPO1和VvPPO2与果皮褐变有关，尤其是浆果皮褐变。与VvPPO1相比，在
‘
Shine Muscat
’
葡萄浆果中，VvPPO2表达特异性上调，与皮肤褐变有关。同样，Rosales等人发现未做任何处理的果梗褐变与 VvPPO1(最初确定为GPO1)的增加有关。
[0003]多酚氧化酶PPO是一种公认的参与褐变过程的酶。大量研究证实，水果和蔬菜的褐变主要是由氧化还原酶介导的酶促反应将多酚氧化成深棕色的醌类。常用于延缓果蔬褐变的方法是通过降低酶含量或抑制酶活性来抑制褐变。多酚氧化酶(PPO)主要参与了葡萄浆果和果梗的褐变过程，有学者在基因克隆表达、功能预测方面开展了分子水平的深入分析，但对亚细胞定位的具体功能位置未做观察。因此，对PPO的进一步研究将有助于从根本上解决鲜食葡萄果穗褐变问题。
[0004]多酚氧化酶在植物中的作用和调控措施较为复杂，在葡萄果梗褐变中的研究尚处于空白。因此，作为基因功能研究的一部分，通过对编码葡萄果梗多酚氧化酶的基因开展亚细胞定位研究，旨在为进一步研究该基因的分子生物调控机制究奠定基础。

技术实现思路

[0005]为解决上述
技术介绍
中提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，具备通过对编码葡萄果梗多酚氧化酶的基因开展亚细胞定位研究，旨在为进一步研究该基因的分子生物调控机制究奠定基础的优点，解决了现有对多酚氧化酶的亚细胞定位研究不足的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，包括以下检测步骤：步骤S1、克隆，步骤S2、载体构建，步
骤S3、烟草转基因，步骤S4、转基因烟草检测，步骤 S5、转基因烟草观察；
[0007]步骤S1：VvPPO1 cDNA全长克隆；
[0008]步骤S2：植物荧光表达载体的构建；
[0009]步骤S3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验；
[0010]步骤S4：转基因烟草植株的获得及其PCR检测；
[0011]步骤S5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察。
[0012]作为本专利技术优选的，所述步骤S2在构建时，将目的片段连接到载体pBI121 (携带pENTER/D
‑
TOPO)上，该载体不包含终止密码子TGA的C末端融合物，得到VvPPO1与GFP融合的瞬时表达载体，根据VvPPO1全长cDNA的ORF设计一对引物：正向：5
’‑
CACCATGGCTTCTCTTT CTCCTC
‑3’
，反向：5
’‑ꢀ
AGAGGCAAGCTCAATTTCAATTCCG
‑3’
，然后使用Gateway LR Clonase II Plus Enzyme mix将这些基因重组到pGWB5
‑
GFP目的载体中，载体相关信息如下： pGWB5序列信息：NCBI中登录号为AB289768，序列为(AAGCTT)
–
35S promoter
‑‑
//(TCTAA)TCAAACAAGTTTGTACAAAAAA
‑‑
(CmR，ccB)
ꢀ‑‑
TTCTTGTACAAAGTGGTTCGATCTAGATCCATG—(GFP sequence)
‑‑
(GAGCTC)，可形成载体(35S promoter，C
‑
sGFP)(
‑‑
35S promoter
‑
R1
‑
ccdB
‑
R2
‑
sGFP
‑‑
)， pGWB5载体和LR反应产物融合后具有抗卡那霉素和潮霉素(50ug ml
‑
1)特性， GFP序列信息：TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG GGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTGVAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGC GAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGKTTCATCTGCACCACCGGCAAGCT GCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGVCAGTGCTTCAGCCGCTACC CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCGTACGTCCAGGAGCGC ACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCFGAGGGCGACAC CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGLGGGCACA AGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCGATC AAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAG QCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTC CGCCACTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCG CCGGGATCACTCACGGCATGGACGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，其特征在于，包括以下检测步骤：步骤S1、克隆，步骤S2、载体构建，步骤S3、烟草转基因，步骤S4、转基因烟草检测，步骤S5、转基因烟草观察；步骤S1：VvPPO1 cDNA全长克隆；步骤S2：植物荧光表达载体的构建；步骤S3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验；步骤S4：转基因烟草植株的获得及其PCR检测；步骤S5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察。2.根据权利要求1所述的一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，其特征在于：所述步骤S2在构建时，将目的片段连接到载体pBI121(携带pENTER/D
‑
TOPO)上，该载体不包含终止密码子TGA的C末端融合物，得到VvPPO1与GFP融合的瞬时表达载体，根据VvPPO1全长cDNA的ORF设计一对引物：正向：5
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CACCATGGCTTCTCTTT CTCCTC
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，反向：5
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AGAGGCAAGCTCAATTTCAATTCCG
‑3’
，然后使用Gateway LR Clonase II Plus Enzyme mix将这些基因重组到pGWB5
‑
GFP目的载体中，载体相关信息如下：pGWB5序列信息：NCBI中登录号为AB289768，序列为(AAGCTT)
–
35S promoter
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//(TCTAA)TCAAACAAGTTTGTACAAAAAA
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(CmR，ccB)
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TTCTTGTACAAAGTGGTTCGATCTAGATCCATG—(GFP sequence)
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(GAGCTC)，可形成载体(35S promoter，C
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R1
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ccdB
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R2
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)，pGWB5载体和LR反应产物融合后具有抗卡那霉素和潮霉素(50ug ml
‑
1)特性，GFP序列信息：TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTGVAACGGCCACAAGTTCAGCGTGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴忠红，吴斌，魏佳，杜鹃，郑素慧，阿塔吾拉，
申请(专利权)人：新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，
类型：发明
国别省市：