用HPLC-ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法技术

本发明专利技术提供了用HPLC

【技术实现步骤摘要】
用HPLC
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ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法


[0001]本专利技术属于成分检测领域，涉及检测发酵液中金霉素含量的方法，具体的涉及用HPLC
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ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法。

技术介绍

[0002]金霉素是由金色链霉菌Streptomyces aureofacieus发酵产生的，属于四环素类抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，可治疗畜禽的伤寒、白痢等疾病。
[0003]金色链霉菌发酵液中的金霉素含量随发酵周期的延长逐渐增加，并且其中的副产物如4
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差向金霉素、四环素等也逐渐增加，而生产上均以金霉素含量衡量其发酵水平。行业中普遍应用比色法检测，即利用四环素类抗生素在较酸的溶液中形成脱水衍生物，因共轭双键的增加，脱水金霉素呈稳定的色泽较深的黄色，在440nm下用分光光度计测定其消光值从而测定其含量。此种方法因无法特异性区分金霉素及其副产物中的四环素类代谢产物而缺乏准确性，并且需创造反应条件，进行多步稀释并加热才能，完成脱水反应，生成脱水物，因而费时费力。
[0004]蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，响应不依赖于样品的光学特性，不受其官能团的影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，包括没有紫外吸收的物质。ELSD的响应值与样品的质量成正比，对几乎所有物质都有响应值，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种通用型检测方法，能尽量快地检测出金霉素发酵液中金霉素的含量，有效指征金霉素发酵水平，为工艺调控和产品质量保驾护航。
[0006]本专利技术为实现其目的采用的技术方案是，一种HPLC
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ELSD检测金霉素的方法，包括以下步骤：
[0007]a、制备金霉素对照品溶液和样品溶液；
[0008]b、标准曲线绘制：将3
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5份不同浓度的对照品溶液分别注入HPLC
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ELSD进行测定，洗脱方式为等度洗脱，记录对照品色谱图和峰面积；以金霉素峰面积对数值与相应度值的对数进行线性回归，得到一元回归线性方程；
[0009]c、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC
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ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以b步骤所得一元线性线性回归方程计算样品溶液色谱图中金霉素含量。
[0010]HPLC
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ELSD进行测定的色谱条件如下：
[0011]色谱柱：C18 4.6*250mm 5.0μm；
[0012]柱温：20
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30℃；
[0013]进样量：20
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50μL；
[0014]流速：0.3
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1.0mL/min；
[0015]漂移管温度：110
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120℃；
[0016]增益系数：1；
[0017]气体流速：2.0
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3.0L/min；
[0018]运行时间：20
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30min；
[0019]流动相：0.01mol/L醋酸：乙腈：1％醋酸铵＝10：3：2
[0020]所述金霉素对照品溶液金霉素对照品溶液以0.1mol/L盐酸溶液稀释至浓度为0.1
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1.0mg/mL。
[0021]所述金霉素样品溶液的制备方法为：取金霉素发酵液加0.1mol/L盐酸制成每1mL中含金霉素0.1
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1.0mg的溶液，搅拌摇匀，滤纸过滤，吸取滤液，用微孔滤膜过滤，作为金霉素样品溶液。
[0022]所述流动相中醋酸浓度为0.01mol/L醋酸，醋酸铵浓度为1％。
[0023]所述流动相的处理方法为：醋酸和醋酸铵溶液用水系微孔滤膜真空抽滤，乙腈用有机系微孔滤膜真空抽滤后，按照醋酸：乙腈：醋酸铵＝10:3:2的比例混合均匀，超声脱气15
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20min。
[0024]所述金霉素样品溶液为金霉素发酵液样品溶液。
[0025]本专利技术的有益效果为：本方法样品处理步骤简单，检测更加快速及时；能有效识别目标金霉素色谱峰，与其他四环类副产物有效区分，准确指征发酵水平和发酵程度。
[0026]本专利技术采用的方法操作简便，准确度高，重复性好，可作为发酵法生产金霉素企业的生产控制方法，准确监控发酵过程中金霉素含量的变化，及时指导生产工艺调控，保证产品质量。
附图说明
[0027]图1
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1为实施例1对照品溶液色谱图；
[0028]图1
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2为实施例1样品溶液色谱图；
[0029]图2
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1为实施例2对照品溶液色谱图；
[0030]图2
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2为实施例2样品溶液色谱图；
具体实施方式
[0031]下面以具体实施例来说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于此：
[0032]本专利技术提供了用HPLC
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ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法，：包括以下步骤：
[0033]a、制备金霉素对照品溶液和金霉素发酵液样品溶液；
[0034]b、绘制标准曲线：分别测定3
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5个用盐酸溶液稀释至不同浓度的金霉素对照品溶液，以金霉素峰面积的对数值与相应浓度值的对数进行一元线性回归；
[0035]c、样品测定与结果计算：将金霉素发酵液样品溶液注入HPLC
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ELSD测定，记录色谱图和峰面积，并用步骤b中所得一元线性回归方程计算样品溶液色谱图中的金霉素含量。
[0036]分别计算对照品溶液3次进样峰面积平均值的对数值为x3、x2、x1，其对应的含量的对数值分别为y3、y2、y1，以金霉素峰面积的对数值与相应含量的对数值进行一元线性回归，得到一元线性回归方程：
[0037]y＝ax+b
[0038]y：金霉素含量的对数值；
[0039]x：样品峰面积的对数值；
[0040]计算样品峰面积的对数值为x
i
，将其带入c步骤所得一元线性回归方程，计算样品溶液色谱图中金霉素的含量对数值y
i
。
[0041]y
i
＝ax
i
+b
[0042]则样品中金霉素的含量：
[0043][0044]优选的，HPLC
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ELSD进行测定的色谱条件如下：
[0045]色谱柱：C18 4.6*250mm 5.0μm；
[0046]柱温：20
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30℃；
[0047]进样量：20
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50μL；
[0048]流速：0.3
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1.0mL/min；
[0049]漂移管温度：110
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120℃；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用HPLC
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ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、制备金霉素对照品溶液和金霉素发酵液样品溶液；b、绘制标准曲线：分别测定3
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5个用盐酸溶液稀释至不同浓度的金霉素对照品溶液，以金霉素峰面积的对数值与相应浓度值的对数进行一元线性回归；c、样品测定与结果计算：将金霉素发酵液样品溶液注入HPLC
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ELSD测定，记录色谱图和峰面积，并用步骤b中所得一元线性回归方程计算样品溶液色谱图中的金霉素含量。2.根据权利要求1所述的用HPLC
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ELSD法检测发酵液中金霉素含量的方法，其特征在于：HPLC
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ELSD进行测定的色谱条件如下：色谱柱：C184.6*250mm5.0μm；柱温：20
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30℃；进样量：20
‑
50μL；流速：0.3
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1.0mL/min；漂移管温度：110
‑
120℃；增益系数：1；气体流速：2.0
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3.0L/min；运行时间：20
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30min；流动相：0.01mol...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，杜精精，
申请(专利权)人：河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：