一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于提取及其分析化学技术领域，更具体的，本发明专利技术涉及一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用，所述甾体固醇类物质来源性检测方法，包括：提取样品中甾体固醇类物质后进行GC

【技术实现步骤摘要】
一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于提取及其分析化学
，更具体的，本专利技术涉及一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]内源性甾体固醇类物质可以通过调节体内代谢水平，因此基于此的合成类固醇药物被国际奥委会列为违禁药物。同时，由于此类物质在人体尿液中存在形式复杂多变，不易检测，如睾酮，由于体内自身合成的睾酮和睾酮制剂中的睾酮的分子结构完全一致，常规的液相/气相质谱仪不能区分体内自身合成的睾酮和外源摄入的睾酮。同时，由于个体差异、不同的生理状况，尿样中的睾酮浓度变化范围较大，因此，尿样中外源性的睾酮及其代谢物的确证，一直以来都是兴奋剂检测领域的重点和难点。建立同位素比质谱法检测尿中类固醇来源的方法，已成为兴奋剂检测的重中之重，用来确定是否使用内源性类固醇兴奋剂具有重要意义。
[0003]目前，用同位素比质谱方法检测内源性类固醇的研究所经历的时间并不长，1990年首次报告人体自身分泌的睾酮与合成制剂的睾酮的δ
13
C值是有差异的，证明该分析方法在兴奋剂检测中具有很大的应用价值。大多数人工合成的类固醇激素均来自于植物基质，相对于人体自身合成的类固醇激素，人工合成的类固醇激素具有更贫乏的δ
13
C值。当人体摄入外源性激素后，其体内的内源性物质及其代谢物的δ
13
C值将随之变化，而与外源性激素代谢无关的其他类固醇激素则不受影响。同时，各国对样品前处理的方法差别较大，各有特色，目前国际常用的方法是使用两次液相分离纯化，提高分析物的纯度，或通过化学衍生化手段，使分析物在气相色谱上完全分离。但是共同要解决的问题是：操作繁琐，费时，灵敏度低，样品用量大等，本专利技术开发的方法相对快速，重现性好，样品用量少，满足样品分析要求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的一些问题，本专利技术第一个方面提供了一种甾体固醇类物质来源性检测方法，包括：提取样品中甾体固醇类物质后进行GC
‑
C
‑
IRMS检测分析δ
13
C值。
[0005]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述GC
‑
C
‑
IRMS检测分析过程包括：甾体固醇类物质分别进行气相色谱分析、升温燃烧程序以及同位素比质谱分析，其中气相色谱分析中色谱柱的升温程序包括：升温至150℃，保温1
‑
5min；以30℃/min升温至200℃；接着以2.5℃/min升温至200
‑
290℃，保温1
‑
3min；然后以30℃/min升温至290
‑
350℃，保温1
‑
3min。
[0006]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述气相色谱分析中色谱柱的柱长为15
‑
60m，内径为0.25
‑
0.32mm，液膜厚度为0.15
‑
0.25μm。
[0007]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述提取样品中甾体固醇类物质过程包括：样品在缓冲液以及酶的作用下，于50
‑
60℃酶解1
‑
3h后，冷却，加入碱液以及萃取剂，震荡离心，取上清液，于65
‑
75℃下N2吹干后加入高效液相色谱洗脱液进行HPLC分离纯化；之后在
65
‑
80℃N2吹干后，使用IRMS上机溶液进行溶解，即得。
[0008]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，所述磷酸盐缓冲液的pH为6
‑
6.9。
[0009]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述碱液的浓度为15
‑
25wt％。
[0010]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述碱液中溶质为碳酸钠和/或碳酸氢钠。
[0011]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述IRMS上机溶液包括有机酯类和/或C4
‑
C8烷烃。
[0012]作为本专利技术的一种优选的技术方案，所述萃取剂为重均分子量为70
‑
100的有机醚类溶剂。
[0013]本专利技术第二个方面提供了一种所述甾体固醇类物质来源性检测方法在检测尿液中兴奋剂中的应用。
[0014]本专利技术与现有技术相比具有以下优势：
[0015](1)采用本申请甾体固醇类物质来源性检测方法，尤其是根据本申请方法提取出尿液中甾体固醇类物质后进行GC
‑
C
‑
IRMS检测分析，能够100％准确判断其是内源性还是外源性；
[0016](2)本申请采用甲基叔丁基醚为萃取剂，萃取完全，检出限低，增加了本申请检测方法的适用性；
[0017](3)本申请中磷酸盐缓冲液pH控制在6
‑
7，特别是6.86时，经过本申请后期酶解后，在本申请GC/C/IRMS检测后对于甾体固醇类物质的判断更为准确；
[0018](4)本专利技术建立的GC
‑
C
‑
IRMS检测方法的检测浓度线性范围为10～13000ng/mL，定量限低至10ng/mL，在检测过程中，不受不同体质、年龄、种族以及运动项目的限制，适用范围广；
[0019](5)本专利技术开发的检测方法，稳定性好，符合WADA对内源性甾体兴奋剂的不确定度检测标准；
[0020](6)相比国际常用的二次液相分离与化学衍生化结合的检测方法，本申请中只需一次液相分离，无需衍生化，分析时间短，检测效率高。
附图说明
[0021]图1
‑
8分别为Etio、An、PD、T、5βdiol、5αdiol、ET、11OHAn的线性分布图；
[0022]图9
‑
15分别为Keeling plot进行线性拟合模型；
[0023]图16为本专利技术进样检测标品混标(5α
‑
diol、5β
‑
diol、ET、11OHAn)得到的同位素谱图；
[0024]图17为本专利技术进样检测标品混标(Etio、An、PD、T)得到的同位素谱图；
[0025]图18为本专利技术进样检测样本中单个物质(11OHAn)得到的同位素谱图；
[0026]图19为本专利技术进样检测样本中单个物质(T)得到的同位素谱图；
[0027]图20为本专利技术进样检测样本中单个物质(5β
‑
diol)得到的同位素谱图；
[0028]图21为本专利技术进样检测样本中单个物质(5α
‑
diol)得到的同位素谱图；
[0029]图22为本专利技术进样检测样本中单个物质(Etio)得到的同位素谱图；
[0030]图23为本专利技术进样检测样本中单个物质(An)得到的同位素谱图；
[0031]图24为本专利技术进样检测样本中单个物质(PD)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甾体固醇类物质来源性检测方法，其特征在于，包括：提取样品中甾体固醇类物质后进行GC
‑
C
‑
IRMS检测分析δ
13
C值。2.根据权利要求1所述甾体固醇类物质来源性检测方法，其特征在于，所述GC
‑
C
‑
IRMS检测分析过程包括：甾体固醇类物质分别进行气相色谱分析、升温燃烧程序以及同位素比质谱分析，其中气相色谱分析中色谱柱的升温程序包括：升温至150℃，保温1
‑
5min；以30℃/min升温至200℃；接着以2.5℃/min升温至200
‑
290℃，保温1
‑
3min；然后以30℃/min升温至290
‑
350℃，保温1
‑
3min。3.根据权利要求2所述甾体固醇类物质来源性检测方法，其特征在于，所述气相色谱分析中色谱柱的柱长为15
‑
60m，内径为0.25
‑
0.32mm，液膜厚度为0.15
‑
0.25μm。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述甾体固醇类物质来源性检测方法，其特征在于，所述提取样品中甾体固醇类物质过程包括：样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，卓悦，徐昕，陈佩杰，
申请(专利权)人：上海体育学院，
类型：发明
国别省市：