一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒，涉及生物检测技术领域，本发明专利技术提供了一种检测叶酸及其代谢物的检测方法，通过采用特定作用浓度的抗坏血酸和巯基乙醇与样本接触，使得样本中的叶酸及其代谢物具有很好的稳定性，有效增强液相色谱串联质谱检测叶酸及其代谢物的准确度和精密度。本发明专利技术的方法能够同时实现对叶酸、四氢叶酸、5

【技术实现步骤摘要】
一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体而言，涉及一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]叶酸由蝶啶、对氨基苯甲酸和L
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谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，是一种水溶性维生素，为人体细胞生长和繁殖所必需，是孕妇的营养素补充剂。补充叶酸可显著降低新生儿神经管缺陷的发生率，也有助于降低心脑血管疾病的发生风险。
[0003]血清叶酸被认为是反映近期叶酸营养状况的指标，单独检测血清叶酸水平并不能区分一过性膳食叶酸摄入不足和慢性叶酸缺乏状态；而红细胞叶酸水平可反映慢性或长期(4个月内)叶酸营养状况，更适合于评价叶酸干预效果。叶酸检测方法较多，其中，最可靠的是微生物法，其他的叶酸检测方法还包括经典的高效液相色谱法、免疫法和离子捕获法等。
[0004]活性叶酸是5
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甲基四氢叶酸，是稳定性的天然叶酸，无需代谢，可直接进入循环，被人体吸收利用。它是由亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)催化生成，是红细胞中存在的主要叶酸类型。MTHFR催化生成5
‑
甲基四氢叶酸这步酶促反应至关重要，是叶酸代谢通路中的限速步骤。
[0005]目前，临床所使用的叶酸检测方法主要为化学发光法的红细胞叶酸，与其他检测方法相比，精密度较差，在低水平叶酸浓度时，普遍检测偏高，并且不能对活性叶酸等进行分型；针对两个MTHFR的基因位点检测最多可以直观的判断出基因型但推知该酶的活性能力，并不能直观了解因为酶活力而导致的叶酸分布和存储情况，进而无法了解临床补充叶酸后真实发生作用的活性叶酸情况，为后续的临床指导带来困扰。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]第一方面，本专利技术实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括：将红细胞裂解后的血液样本、内标溶液与保护剂混合，得到加标样本，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇；在所述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，所述巯基乙醇的体积分数≥0.1％；将所述加标样本进行蛋白失活、水解孵育和固相萃取后，用于后续对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测。
[0010]第二方面，本专利技术实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括采用如前述实施例所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法对样本进行前处理，然后对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
[0011]第三方面，本专利技术实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测试剂盒，其包括：保护剂与叶酸及其代谢物的内标品；其中，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇，所述保护剂中抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，巯基乙醇的体积分数≥0.1％。
[0012]本专利技术具有以下有益效果：
[0013]本专利技术提供了一种检测叶酸及其代谢物的前处理方法和检测方法，主要通过采用特定作用浓度的抗坏血酸和巯基乙醇与样本接触，使得样本中的叶酸及其代谢物具有很好的稳定性，有效增强了液相色谱串联质谱检测叶酸及其代谢物的准确度和精密度。
[0014]本专利技术的检测方法能够同时实现对叶酸、四氢叶酸、5
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甲基四氢叶酸和5
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甲酰四氢叶酸含量的检测，进而能够获得总叶酸含量以及活性叶酸比的结果，具有稳定性高，精密度好等优点，且整个检测过程方便快捷，适于推广。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]图1为质控样本QCM的质谱检测的总离子流图，其中，
①
四氢叶酸
②5‑
甲基四氢叶酸
③5‑
甲酰四氢叶酸
④
叶酸。
具体实施方式
[0017]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0018]本专利技术克服了现有检测的弊端，具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，可以对于叶酸及叶酸代谢物进行分型定量，并在叶酸储量、活性叶酸总量和活性叶酸占比的检测上具有明显的优势。
[0019]具体地，本专利技术实施例提供了一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其包括：将红细胞裂解后的血液样本、内标溶液与保护剂混合，得到加标样本，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇；在所述加标样本中所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，所述巯基乙醇的体积分数≥0.1％；
[0020]将所述加标样本进行蛋白失活、水解孵育和固相萃取后，用于后续对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测。
[0021]本文中“所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇”是指保护剂可以包括单独分装的抗坏血酸和巯基乙醇，或含有抗坏血酸和巯基乙醇中至少一种的溶液，只要添加后能够使得加标样本中抗坏血酸和巯基乙醇达到设定浓度即属于本申请所述的保护剂。
[0022]具体地，抗坏血酸除了防止叶酸损失的作用外，还有加速裂解红细胞的作用，作用浓度在0.1％～2％之间可以满足基本要求，具体可以在0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选地，在所
述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％，优选为0.2％～0.9％，更优选为1％，优选范围的效果更好。
[0023]巯基乙醇能够显著提高叶酸及其代谢物的稳定性，且作用浓度在0.1％以上都具有较好的效果，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2.0％中的任意一种或任意两种之间的范围。在所述加标样本中，所述巯基乙醇的体积分数为0.1％～2％，优选为0.2％～1％，优选范围的效果更好。
[0024]优选地，所述保护剂含有抗坏血酸和巯基乙醇的水溶液。
[0025]保护剂中的抗坏血酸和巯基乙醇还有利于保护样本前处理过程的蛋白失活和水解孵育两个过程的叶酸及其代谢物的保护，进而使得液相色谱串联质谱的检测结果更加的稳定和准确。
[0026]优选地，在进行所述蛋白失活前，对加标样本进行冻融裂解。对加标样本进行冻融裂解，有利于红细胞内的叶酸物质得到充分释放，提高红细胞叶酸的存储稳定性，而未冻融裂解的样本无法完全地释放红细胞内的叶酸物质。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，其包括：将红细胞裂解后的血液样本、内标溶液与保护剂混合，得到加标样本，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇；在所述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，所述巯基乙醇的体积分数≥0.1％；将所述加标样本进行蛋白失活、水解孵育和固相萃取后，用于后续对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测。2.根据权利要求1所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，在所述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，优选为0.5％～1％；优选地，在所述加标样本中，所述巯基乙醇的体积分数为0.1％～2％，优选为0.2％～1％；优选地，所述保护剂为含有抗坏血酸和巯基乙醇的水溶液。3.根据权利要求1所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，将进行所述蛋白失活前，所述方法还包括对加标样本进行冻融裂解；优选地，所述冻融裂解的条件包括：温度为
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20～
‑
90℃，时间为10～60分钟；优选地，所述冻融裂解的次数为1～2次；优选地，所述方法还包括将待冻融裂解的样本进行分装，分装为50～150μl。4.根据权利要求1～3任一项所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，所述蛋白失活的条件为：60～100℃，金属浴1～30min，优选为10～20min。5.根据权利要求1～3任一项所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，所述水解孵育的步骤包括：在蛋白失活后的样本中添加动物血清，然后于30～45℃孵育3h以上，优选为3～24h；优选地，所述动物血清选自大鼠血清、小鼠血清和人血清中的至少一种，优选为大鼠血清。6.根据权利要求1～3任一项所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其特征在于，所述固相萃取包括：活化、平衡、上样、淋洗和洗脱步骤；优选地，所述活化采用的活化液包括甲醇；优选地，所述平衡采用的平衡液包括0.01％～2％的氨水；优选地，所述淋洗采用的淋洗液包括水；优选地，所述洗脱采用的洗脱液包括：甲醇、甲酸和稀释液；优选地，所述稀释液中含有抗坏血酸和巯基乙醇，抗坏血酸的质量分数为0.5％～2％，优选为0.5％～1.5％，巯基乙醇的体积分数为≥0.1％，优选为0.1％～2％；优选地，在所述洗脱液中，甲醇的体积分数为85％～95％，优选为88％～92％，所述稀释液的体积分数为3％～13％，优选为6％～10％，甲酸的体积分数为0.1％～5％，优选为1％～5％。7.一种叶酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，其包括采用如权利要求1～6任一项所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法对样本进行前处理，然后对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。8.根据权利要求7所述的叶酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，色谱条件如下：洗针液为7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云龙，栗琳，邵立军，刘胜敏，孙敬茹，周立，丁亮，钱俊伯，
申请(专利权)人：江苏豪思睦可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：