用于可调调节的CA2-IL15融合蛋白制造技术

本公开提供了源自人碳酸酐酶2的药物应答结构域，以及其组合物和使用方法，该人碳酸酐酶2可以针对人白介素15(IL15)有效负载调节蛋白稳定性。白稳定性。白稳定性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于可调调节的CA2
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IL15融合蛋白
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年9月10日提交的美国临时申请号62/898,520的优先权权益。上述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
[0003]对序列表的引用
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且该序列表在此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年9月10日，名为268052_473951_SL.txt，大小为178,693字节。


[0005]本公开涉及源自人碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2,CA2)的药物应答结构域(drug responsive domain,DRD)、其组合物和使用方法，该人碳酸酐酶2可以针对至少一种有效负载来调节蛋白稳定性，该至少一种有效负载包括人白介素15(interleukin 15,IL15)。本公开提供了用于增强来自免疫细胞的应答的CA2生物回路系统、CA2效应子模块、刺激应答元件(stimulus response element,SRE)的多肽；编码所述多肽的多核苷酸；包含所述多肽和/或多核苷酸的载体(vector)和细胞。

技术介绍

[0006]利用本文描述的DRD技术与调节细胞因子功能和/或表达的方法代表了对现有免疫疗法策略的显著改进，并且可以扩展蛋白质治疗剂的领域，该蛋白质治疗剂可以安全和有效地合并到基因转移和过继性T细胞转移(adoptive T cell transfer,ACT)疗法中，包括以前被认为不适合治疗用途的应用。需要改善的自然杀伤细胞(Natural Killer cell,NK细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL)和T细胞类免疫疗法，以例如通过改善工程化免疫细胞的持久性和/或存活率来增强和改善治疗的功能，用于在施用于受试者时的各种免疫疗法中使用。提供了连接到人IL15的CA2 DRD、包括此类DRD的经修饰细胞、以及满足此类需要的组合物和方法。

技术实现思路

[0007]本公开提供了源自人碳酸酐酶2(CA2)的、显示出小分子依赖性稳定性的新型蛋白质结构域。此类蛋白质结构域被称为药物应答结构域(DRD)。在不存在其结合(即稳定化)配体的情况下，DRD正在去稳定(destabilizing)并引起可操作地连接到DRD的有效负载(例如，目标蛋白质(protein of interest,POI))的降解，而在存在其结合配体的情况下，DRD及其可操作地连接的有效负载是稳定化的。DRD及其可操作连接的有效负载的稳定性取决于结合配体的剂量。
[0008]在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激应答元件(SRE)，该刺激应答元件可以包括全部或部分源自人碳酸酐酶2(CA2，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列)的药物应答结构域(DRD)。在一个实施方案中，DRD可以源自全长CA2多肽(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案
中，DRD可以源自人碳酸酐酶的部分或区域。CA2的部分或区域可以选自CA2的氨基酸2
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260(SEQ ID NO:2)。
[0009]在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2中相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2中相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。
[0010]在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2的部分中的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2或其部分中的一个、两个、三个、四个或更多个突变，并且还可以包括额外的氨基酸。在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2的部分中的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，SRE可以包括DRD，该DRD包括CA2或其部分中的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代，并且还可以包括额外的氨基酸。
[0011]本文还提供了分离的多肽变体，该多肽变体包括相对于SEQ ID NO:1的至少一种突变。相对于SEQ ID NO:1的CA2突变的非限制性实施例包括M1del和L156H。在另一方面，DRD为多肽，该多肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，其中CA2突变包括相对于SEQ ID NO:1的Mdel1和L156H。在另一方面，DRD为多肽，该多肽包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸缺失M1del和氨基酸取代L156H，并且还可以包括额外的氨基酸。在另一方面，DRD为多肽，该多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
[0012]本文还提供了包括至少一个效应子模块的生物回路系统。生物回路的效应子模块可以包括刺激应答元件(SRE)，并且SRE可以包括源自人碳酸酐酶2(CA2；SEQ ID NO:1)的DRD或其突变体，该突变体包括CA2相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，生物回路的效应子模块包括SRE，该SRE包括DRD，该DRD包括CA2中相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。生物回路还可以包括至少一个有效负载，该有效负载可以与SRE附接、附加或关联(associated)。有效负载可以包括但不限于(i)包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的人IL15。
[0013]生物回路系统的SRE可以包括CA2(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的一个、两个、三个或更多个突变，诸如但不限于Mdel1和L156H。生物回路系统的SRE可以包括CA2(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，诸如但不限于L156H。
[0014]在一些实施方案中，CA2生物回路系统中的SRE可以是具有突变M1del和L156H的CA2，其中编号与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有关(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，SRE为多肽，该多肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸序或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，SRE为多肽，该多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
[0015]本文描述的生物回路系统可以包括对一种或多种刺激有应答的SRE。
[0016]在一些实施方案中，刺激可以是小分子，其中小分子是乙酰唑胺(acetazolamide,ACZ)。
[0017]在另一方面，本公开提供了一种包括至少一个有效负载的效应子模块。在一些实施方案中，效应子模块包括SRE，该SRE包括可操作地连接到IL15有效负载的CA2 DRD。在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸分子，所述核酸分子包括编码重组蛋白的多核苷酸，所述重组蛋白包括可操作地连接到IL15有效负载的药物应答结构域(DRD)，其中所述DRD源自人碳酸酐酶II(CA2)并且包括相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个、两个、三个、四个或更多个突变。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述DRD包括相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个、两个、三个或四个氨基酸添加、取代和/或缺失。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中，所述DRD包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其中，所述DRD由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的核酸分子，其中，所述IL15有效负载包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的核酸分子，其中，所述IL15有效负载为所述DRD的N
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末端。7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中，所述IL15有效负载是膜结合IL15多肽。8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中，所述膜结合IL15多肽包括IL15多肽组分，所述IL15多肽组分包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列、跨膜结构域和胞内尾区，其中，所述跨膜结构域为所述IL15多肽组分的C
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末端，且所述胞内尾区为所述跨膜结构域的C
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末端。9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中，所述膜结合IL15多肽还包括所述IL15多肽组分与所述跨膜结构域之间的接头。10.根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸分子，其中，所述IL15有效负载还包括选自由以下构成的组的一种或多种组分：(a)前导序列；(b)GS接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞内尾区。11.根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸分子，其中，所述IL15有效负载还包括：(a)前导序列；(b)GS接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞内尾区。12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列。13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:25的核酸序列。14.根据权利要求11所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:28的氨基酸序列。15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:29的核酸序列。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子还包括第二多核
苷酸，所述第二多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其中，所述CAR或TCR包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述第二多核苷酸编码CAR，所述CAR包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中，所述CAR包括对CD19特异的抗原结合结构域。19.一种载体，所述载体包括根据权利要求1
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18中任一项所述的核酸分子。20.根据权利要求19所述的载体，其中，所述载体是质粒或病毒载体。21.根据权利要求20所述的载体，其中，所述载体是源自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、甲病毒、黄病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、弹状病毒、逆转录病毒、慢病毒、新城疫病毒(NDV)、痘病毒或小核糖核酸病毒的病毒载体。22.根据权利要求21所述的载体，其中，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体或溶瘤病毒载体。23.根据权利要求22所述的载体，其中，所述病毒载体选自慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。24.一种重组蛋白，所述重组蛋白由根据权利要求1
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15中任一项所述的核酸分子编码。25.一种细胞，所述细胞包括根据权利要求1
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18中任一项所述的核酸分子、根据权利要求18
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23中任一项所述的载体、或根据权利要求24所述的重组蛋白。26.根据权利要求25所述的细胞，其中，所述细胞为细菌细胞。27.根据权利要求25所述的细胞，其中，所述细胞为哺乳动物细胞。28.根据权利要求27所述的细胞，其中，所述哺乳动物细胞为人细胞。29.根据权利要求28所述的细胞，其中，所述人细胞为T细胞、自然杀伤(NK)细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。30.根据权利要求29所述的细胞，其中，所述细胞为CD4+或CD8+T细胞。31.根据权利要求29...

【专利技术属性】
技术研发人员：库特卢，
申请(专利权)人：黑曜石疗法公司，
类型：发明
国别省市：