胆红素含量检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了胆红素的含量检测方法。所述检测方法为液相色谱

【技术实现步骤摘要】
胆红素含量检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及分析检测
，具体涉及一种胆红素的定性定量检测分析方法，可应用于测试样本中胆红素的定性定量检测。

技术介绍

[0002]胆红素是红细胞被破坏后释放出的血红素脱铁形成的，80％胆红素来源于脾和肝，其余胆红素来源于骨髓。胆红素有三种存在形式，间接胆红素或非结合胆红素、结合胆红素、δ胆红素。其中结合胆红素和δ胆红素可以和重氮试剂直接反应，被称为直接胆红素。直接胆红素又称结合胆红素，是由间接胆红素进入肝后受肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用与葡萄糖醛酸结合生成的。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。各种类型的肝炎、肝硬化、阻塞性黄疸均可见直接胆红素含量增高，而且比转氨酶敏感。严重贫血时血清中的直接胆红素含量降低。因此，胆红素含量的检测有着非常重要的临床意义。
[0003]目前检测游离胆红素和结合胆红素的生化法主要有：重氮盐改良J-G法、胆红素氧化酶法、化学氧化法、钒酸法以及经皮测胆法等。重氮法以及氧化酶法都容易受到血脂，溶血的干扰。同时传统生化法需要的血量较大，并且这些检测方法对生物样本有严格要求，只能检测血清或血浆中的结合胆红素。经皮胆红素仪只能检测总胆红素，而不能区分游离胆红素和结合胆红素。
[0004]中国专利申请CN109991177 A披露了一种缓冲试剂，可用于氧化酶法测定直接胆红素含量的方法。中国专利申请CN109541238 A系利用氧化酶和其底物反应生成过氧化氢，再使过氧化氢和过氧化物酶反应释放氧气，将溶液中的直接胆红素氧化成胆绿素，进而使得吸收峰在450nm处发生下降，记录下降程度计算得出直接胆红素含量。中国专利申请CN108613976 A披露了用于全自动生化分析仪的检测试剂盒。中国专利申请CN111579703 A通过使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物的定性与定量方法，利用三种化合物的标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件、质谱检测条件及质谱参数优化。
[0005]以上现有技术中提供了对间接胆红素和直接胆红素的定量测定，未见有对直接胆红素各成分的定量测定。本专利技术旨在弥补现有技术之不足，提供含有胆红素的样品中的成分的定性定量分析方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供含有胆红素的检测样本中胆红素，更具体指胆红素各成分的定量检测方法。本专利技术的目的还在于提供能够适用于所述检测方法的试剂盒。本专利技术的目的还在于提供适用于所述检测方法的装置。本专利技术的目的还在于提供所述检测方法在医学检测领域的应用。
[0007]为达到上述专利技术创造目的，本专利技术在第一方面提供了胆红素含量检测方法，所述
检测方法为液相色谱-串联质谱的检测方法；本专利技术所述“胆红素”指检测样本中的游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯(bilirubinβ-monoglucuronide，BMG)、胆红素双葡萄糖醛酸酯(bilirubinγ-diglucuronide，BDG)其中之任一种或多种。在进行含量检测时，可以对前述成分进行单独或联合测定，即胆红素含量可以是游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种的含量或几种的含量或其总和。
[0008]在一些具体的实施方式中，所述液相色谱-串联质谱检测方法，所述液相色谱选自高效液相色谱、超高效液相色谱和纳升液相色谱。
[0009]在一些具体的实施方式中，所述液相色谱选自高效液相色谱，液相色谱柱选自C8和C18硅胶填料柱；作为示例，色谱柱可选自Acquity BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)。在一些具体的实施方式中，色谱柱的柱温在35-45℃，进样量：1-20μL，流速0.2-0.6ml/min。
[0010]在一些具体的实施方式中，所述液相色谱-串联质谱检测方法，液相色谱的流动相的组成为：水相A选自pH值调整剂调整pH值为3-4.5的超纯水；有机相B选自乙腈、乙醇、甲醇、丙二醇、异丙醇中一种或几种的组合。
[0011]在一些具体的实施方式中，所述pH值调整剂选自乙酸铵-乙酸、甲酸铵-甲酸、三氟乙酸和三氯乙酸，作为优选示例，所述pH值调整剂为乙酸铵+乙酸缓冲系统。
[0012]在一些具体的实施方式中，所述有机相B选自乙腈、甲醇、异丙醇中一种或几种的组合；作为优选示例，所述有机相B包括乙腈、甲醇和异丙醇。在一些具体的实施方式中，液相色谱采用梯度洗脱；以示例目的，以下为梯度洗脱方案之一：
[0013][0014]在一些具体的实施方式中，所述液相色谱-串联质谱检测方法中的质谱选自四级杆质谱、飞行时间质谱、离子肼质谱和高分辨轨道肼质谱；所述质谱的条件和设定质谱定性定量检测模式包括：选择电喷离子源(ESI)，根据检测目标化合物的响应选择离子扫描模式；选择多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数。
[0015]在一些具体的实施方式中，提供了优选的检测样本，其特征在于，所述检测方法的检测样本分配于含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系。
[0016]所述第一稳定剂选自在非极性介质中具备一定溶解度的抗氧化剂。所述第一稳定剂可选自丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)中之一种或几种的组合。
[0017]所述第二稳定剂选自在极性介质中具备一定溶解度的抗氧化剂，作为具体实施方式，所述第二稳定剂选自抗坏血酸。作为优选实施例，所述含有第一抗氧化剂和第二抗氧化剂的体系包含第一稳定剂二丁基羟基甲苯(BHT)和第二稳定剂抗坏血酸。
[0018]作为具体实施方式，所述第一稳定剂和第二稳定剂在体系中含量的重量比例范围为1：1-1：50，优选1：10-1：45，进一步优选1：20-1：40，进一步优选1：30-1：40。在一些具体的实施方式中，所述检测样本选自生物样本的有机溶剂分散体系。所述有机溶剂分散体系的
有机溶剂选自甲醇，乙醇，丙酮，丙二醇，乙腈中之种或几种的组合。所述生物样本可选自全血、血浆、血清和干血斑。所述生物样本分散于有机溶剂分散体系后，经离心后取上清液按照本专利技术提供的检测方法进行检测。
[0019]在一些具体的实施方式中，生物样本可按照以下方式进行处理：在生物样本中加入牛磺酸胆红素作为内标，再加入含第一稳定剂和第二稳定剂的有机溶剂分散体系，避光震荡，离心，取上清液进行检测。
[0020]在一些具体的实施方式中，振荡和离心在0-10℃进行，例如，可选0℃、4℃、10℃；震荡条件为1000-2000rpm,优选1400-1500rpm,振荡时间10-30分钟，优选15-25分钟；离心力100000-250000g，离心时间10-30分钟。
[0021]本专利技术的第二方面是提供一种用于检测胆红素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测指标包括游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种的含量或几种的含量或其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胆红素含量检测方法，其特征在于，所述检测方法为液相色谱-串联质谱的检测方法，所述胆红素含量包括游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种的含量或几种的含量或其总和。2.如权利要求1所述的胆红素含量检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测方法，所述液相色谱选自高效液相色谱、超高效液相色谱和纳升液相色谱；优选地，所述所述液相色谱选自高效液相色谱，液相色谱柱选自C8和C18硅胶填料柱。3.如权利要求2所述的胆红素含量检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测方法，液相色谱的流动相的组成为：水相A选自pH值调整剂调整pH值为3-4.5的超纯水；有机相B选自乙腈、乙醇、甲醇、丙二醇、异丙醇中一种或几种的组合；优选地，所述pH值调整剂选自乙酸铵-乙酸、甲酸铵-甲酸、三氟乙酸和三氯乙酸；进一步优选地，所述pH值调整剂选自乙酸铵+乙酸缓冲系统；优选地，所述有机相B选自乙腈、甲醇、异丙醇中一种或几种的组合；进一步优选地，有机相B包括乙腈、甲醇和异丙醇。4.如权利要求1至3任一所述的胆红素含量检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测方法，优选地，所述质谱选自四级杆质谱、飞行时间质谱、离子肼质谱和高分辨轨道肼质谱；优选地，所述质谱的条件和设定质谱定性定量检测模式包括：选择电喷离子源(ESI)，根据检测目标化合物的响应选择离子扫描模式，选择多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数。5.如权利要求1所述的胆红素含量检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测样本分配于含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系；优选地，所述第一稳定剂选自丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)中之一种或几种的组合；优选地，所述第二稳定剂选自抗坏血酸；优选地，所述含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系包含为二丁基羟基甲苯(BHT)和抗坏血酸。6.如权利要求1所述的胆红素含量检测方法，其特征在于，所述检测样本选自生物样本的有机溶剂分散体系；优选地，所述生物样本选自全血、血浆、血清和干血斑；优选地，所述有机溶剂分散体系的有机溶剂选自甲醇，乙醇，丙酮，丙二醇，乙腈中之一种或几种的组合；优选地，所述检测样本经离心后取上清液作为检测样本进行检测。7.一种用于检测胆红素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测指标包括游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种的含量或几种的含量或其总和；优选地，所述试剂盒包含游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种或多种的标准品和内标准品；优选地，所述内标准品包括牛磺酸胆红素标准品。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种或多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟，谢国祥，周科军，
申请(专利权)人：深圳市绘云生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：